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ICS65.020.30B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2536—2015副结核分支杆菌实时荧光PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis2015-10-15发布2015-12-15实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2536—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位:辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:吴斌、万超、屈菲。DB21/T2536—20151副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了副结核分枝杆菌(Mycobacteriumaviumsubssp.paratuberculosis)实时荧光PCR检测方法。本标准适用于副结核分枝杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值:达到阈值的循环数(CycleThreshold)DEPC:焦碳酸乙二酯(Diethylpyrocarbonate)Taq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)实时荧光PCR:荧光逆转录聚合酶链反应(RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction)4原理采用TaqMan方法,比对副结核分枝杆菌基因组5'端非编码区最保守的核苷酸序列,设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示),3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表示),它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。PCR反应进入退火阶段时,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试剂和材料DB21/T2536—20152除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水;所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1试剂5.1.1PBS:配制方法见附录A.1。5.1.2Triton-X-1005.1.3Trizol裂解液。5.1.4三氯甲烷。5.1.5柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液:配制方法见附录A.2。5.1.675%乙醇:配制方法见附录A.3。5.1.7异丙醇(-20℃预冷)。5.1.84%氢氧化钠:配制方法见附录A.4。5.1.94%硫酸:配制方法见附录A.5。5.1.10其他试剂:荧光PCR反应缓冲液:含50mmol/LKCl:配制方法见附录A.6,10mmol/LTris-HCl(pH8.3):配制方法见附录A.7,2.5mmol/LMgCl2:配制方法见附录A.8,5%二甲基亚砜(DMSO):配制方法见附录A.9,5%甘油:配制方法见附录A.10。可采用等效商品化试剂。5.1.11dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL),UDG酶。5.1.12引物:以副结核F57基因序列合成一对特异性引物:上游引物5'-GTCAGCGGCGGTCCAG-3',下游引物5'-GCAGCTCCAGATCGTCATTC-3',TaqMan探针(FAM)5'-ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC-3'(BHQ-1)均配制成10umol/L,-20℃保存。5.2仪器与耗材5.2.1接种棒5.2.2荧光PCR检测仪。5.2.3高速台式冷冻离心机(最高可达13000r/min)。5.2.4微量移液器:0.5μL~10μL,5μL~20μL,20μL~200μL,100μL~1000μL。5.2.5组织匀浆器。5.2.6冰箱(2℃-8℃)。5.2.7微量可调移液器。5.2.8离心管。5.2.9微量带芯吸嘴(10μL,100μL,1000μL)。5.3仪器与耗材6生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作,应遵守SN/T1193的有关规定。7操作步骤7.1样本的采集与处理7.1.1培养物:直接取液体培养基培养的菌液,对于在固体培养基上生长的菌落,用接种棒挑取适量菌样,放到0.01mol/LpH7.6PBS中,振荡混匀形成悬浮菌液。DB21/T2536—201537.1.2血样:用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,无菌分离血清。7.1.3奶样:无菌采集奶液于灭菌的容器中。7.1.4粪便:选取新鲜粪便(腹泻或或有粘液、血液、粘膜的粪便),盛于灭菌容器中。7.1.5组织:选取有明显病变的肠段,回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结。8操作方法8.1样品前处理8.1.1血样、培养物(菌液)前处理:取2ml全血样品或培养物(菌液),15000g离心10min,弃上清;加等体积灭菌双蒸水充分震荡,15000g离心10min,弃上清;收集沉淀物,继续进行核酸提取。8.1.2奶样前处理:取10ml奶液,加100μLTriton-X-100,震荡混匀,15000g离心10min,弃上清;加1ml0.01mol/LpH7.6PBS,充分振荡混匀,15000g离心10min,弃上清;收集沉淀物,继续进行核酸提取。8.1.3粪样前处理:取粪样2g,按1:5的比例加入4%硫酸溶液,充分振荡混匀,室温静置0.5h;取上层约3ml液体,5000g离心1min,取上清,15000g离心10min,弃上清;加等量0.01mol/LpH7.6PBS,充分振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000g离心10min,弃上清,重复本步骤一次;收集沉淀物,继续进行核酸提取。8.1.4组织样品前处理:取适量组织样品(剔除脂肪,被膜),剪碎,按1:5的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液,充分研磨;加等量4%氢氧化钠溶液,继续研磨5-10min,使组织液化;充分振荡混匀,75℃室温静置0.5h;取上层约3ml液体,5000g离心1min,取上清,15000g离心10min,弃上清;加等量0.01mol/LpH7.6PBS,充分振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000g离心10min,弃上清,重复本步骤一次;收集沉淀物,继续进行核酸提取。8.2核酸提取自上述完成前处理的样品中加入100μlDNA提取液,充分振荡混匀,55℃温浴30min,98℃加热10min,瞬时离心使液滴聚集管底,加等体积三氯甲烷,振荡混匀,12000g离心5min,取上清。粪便样品进行以下步骤:加3倍体积异丙醇,颠倒混匀,放置5min;4℃15000g离心10min,弃上清,加3倍体积70%乙醇,振荡洗涤;4℃15000g离心10min,弃上清,室温干燥5min;加入50μl无DNA酶、无RNA酶水,混匀、溶解核酸,直接用于PCR。也可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒。8.3实时荧光PCR反应8.3.1反应体系8.3.2用漩涡混匀器将表1中各组分混匀后瞬间离心,备用。荧光PCR反应体系(25μL,核酸模板2μL),10×PCR缓冲液【10mmol/LTris-HCl(pH8.3),50mmol/LKCl】2.5μL,2.5mmol/LMgCL25μL,10mmol/LDNTP2μL,上下游引物10μmol/L1μL,探针5μmol/L1μL,1UTaq酶。需配制的荧光PCR预混反应液数量=样品个数+对照个数+1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中,充分混匀,然后再每个PCR光学管中分装20μL。8.3.3反应参数DB21/T2536—20154将7.3.1中离心后的PCR管放入实时荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序。循环参数设置如下:——第一阶段,预变性95℃3min;——第二阶段,95℃3s、60℃33s,40个循环;荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。9结果判定9.1结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。9.2质控标准9.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。9.2.2阳性对照的Ct值应≤28,并出现特定的扩增曲线。9.2.3如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件,此实验视为无效。9.3结果描述及判定9.3.1阴性判定无Ct值并且无扩增曲线,表明样品中无副结核分枝杆菌核酸。9.3.2阳性判定Ct值≤30,且出现特定的扩增曲线,表示样品中存在副结核分枝杆菌核酸。DB21/T2536—20155AA附录A(规范性附录)试剂的配制A.10.01mol/LpH7.6PBS先配制A液、B液。A液(0.2mol/LNaH2PO4溶液):称取一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·H20)27.6g,或二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)31.2g,溶于蒸馏水中,定容至1L。B液(0.2mol/LNa2HPO4溶液):称取十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)71.6g,或二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H20)35.6g,溶于蒸馏水中,定容至1L。称取17g氯化钠,用适量蒸馏水溶解,量取13mLA液和87mLB液,混合,用蒸馏水定容至2L。采用(121士2)℃/0.1Mpa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A.2柠檬酸钠一磷酸缓冲液先配制pH6.8磷酸缓冲液。A液(O.2mol/L磷酸二氢钠溶液):称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)15.61g,加双蒸水溶解,定容至500mL。B液(O.2mol/L磷酸氢二钠溶液):称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H20)35.82g,加双蒸水溶解,定容至500mL。分别量取51mLA液、49mLB液,混合即成100mLpH6.8磷酸缓冲液。称取2.84g柠檬酸钠(Na3C6H5O·2H2O),加入100mLpH6.8磷酸缓冲液中,充分溶解。采用(121士2)℃/0.1MPa,15min高压灭菌后贮存于4℃。A.375%乙醇溶液量取75ml无水乙醇溶液,加入双蒸水中,充分混匀,定容至100ml。室温保存。A.44%氢氧化钠溶液称取8g氢氧化钠,加入双蒸水,充分溶解,定容至200ml。室温贮存。A.54%硫酸溶液98%的浓硫酸10ml,加入双蒸水,定容至450ml。室温贮存。A.650mmol/L氯化钾(50mmol/LKCl)称取3.73g氯化钾,加入双蒸水,充分溶解,定容至1000ml。室温贮存。A.710mmol/LTris-HCl称取0.3028gTris,用双蒸水溶解,然后用HCl调节pH至8.0,最后定容到250mL,室温贮存。A.82.5mmol/LMgCl2称取0.059gMgCl2,用双蒸水溶解,定容到250mL,室温贮存。DB21/T2536—20156A.95%二甲基亚砜量取5ml二甲基亚砜,加入双蒸水中,充分溶解,定容至100ml。室温贮存。A.610%甘油溶液量取10ml甘油,加入双蒸水中,混匀,定容至100ml。室温贮存。_________________________________
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