DB21∕T 2548-2015 种猪氟烷基因PCR-RFLP检测技术规程

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2548—2015种猪氟烷基因PCR-RFLP检测技术规程MethodofPCR-RELPfordetectinghalothanegenotypeinswine2015—12—15发布2016—02—15实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2548—20151前言本标准按照GB/T1.1-2009标准给出的规则制定。附录A、附录B和附录C均为规范性附录。本标准由辽宁医学院提出。本标准由锦州市质量技术监督局归口。本标准起草单位：辽宁医学院。本标准主要起草人：苏玉虹、田玉民、朱弘焱、李立山、王立辛、王希。DB21/T2548—20152种猪氟烷基因PCR-RFLP检测技术规程1范围本标准规定了种猪氟烷基因的PCR-RFLP（聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性）检测条件、检测步骤和结果判定的技术要求。本标准适用于种猪氟烷基因的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求GB/T27476.1-2014检测实验室安全第1部分：总则3术语和定义3.1氟烷基因halothanegene即兰尼定受体1(RyanodineReceptor1,RYR1)基因，定位于猪6号染色体6p1.2，在基因序列数据库（GenBbank）中的登录号为X69465.1，全长29699bp，mRNA为15378bp。该基因编码骨骼肌钙离子释放通道蛋白，是猪应激综合征（PorcineStressSyndrome,PSS）的主效基因。4防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2第七章规定执行。5安全防护实验室安全防护按GB/T27476.1第五章规定执行。DB21/T2548—201536检测条件6.1实验室条件按GB/T19495.2中的规定执行。6.2扩增种猪氟烷基因片段的PCR引物——上游引物F：5′TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCA3′——下游引物R：5′TTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG3′。6.3主要试剂水应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。裂解液、10%SDS、饱和酚、TE缓冲液、TBE缓冲液、上样缓冲液、溴化乙锭（EB）溶液、2×PfuPCRMasterMix、限制性内切酶HhaI及10×M酶切缓冲液、蛋白酶K、DNA分子质量标准品等。具体配制方法参见附录A。6.4主要仪器微量移液器、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、PCR热循环仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、精度0.1g分析天平、恒温金属浴、涡旋混合仪。7检测步骤7.1样品的采集用猪耳号钳子夹取种猪耳部边缘组织0.5cm3，立即置于装有75%乙醇的1.5mLEp白色塑料管中，-20℃保存备用。7.2种猪基因组DNA提取采用常规的酚-三氯甲烷法提取，并测定DNA溶液浓度。具体方法参见附录B。7.3PCR扩增及其产物检测15μL反应体系：0.05μg/μL～0.1μg/μL待测DNA1μL、20μmol/L上下游引物各1μL、2×PfuPCRMasterMix7.5μL、灭菌双蒸水4.5μL。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以灭菌双蒸水为模板的PCR反应作为阴性对照）。PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取2μLPCR产物和2μLDNA分子质量标准品（100bpDNAMarker），2%琼脂糖凝胶（溴化乙锭DB21/T2548—20154（EB）溶液染色）电泳20min～30min（2V/cm～3V/cm），在凝胶成像系统观察条带。PCR扩增结果示意图见附录C中的图C.1。7.4PCR产物的酶切及产物检测取10μLPCR产物（阴性对照同样操作），加入0.5μL限制性内切酶HhaI（10U/μL）和2μL10×Mbuffer，加灭菌双蒸水至20μL；反应条件为37℃温度下反应3h～4h。取10μL酶切产物和3μLDNA分子质量标准品（DL2000DNAMarker），2%琼脂糖凝胶（溴化乙锭（EB）溶液染色）电泳20min～30min（2V/cm），在凝胶成像系统观察条带。酶切图谱见附录C中的图C.2。8结果判定8.1正常种猪出现493bp、166bp两条电泳带，即基因型为HalNHalN，参考附录C中的图C.2泳道3-15判定。8.2隐性携带种猪出现659bp﹑493bp和166bp三条电泳带，即基因型为HalNHaln，参考附录C中的图C.2泳道1-2和17判定。8.3纯合突变种猪出现659bp一条电泳带，即基因型为HalnHaln，参考附录C中的图C.2泳道16判定。9废弃物处理实验过程中所产生的废弃物按GBT27476.1中的规定执行。DB21/T2548—20155附录A（规范性附录）主要试剂及配制方法表A.1主要试剂及配制方法试剂配制方法裂解液（pH8.0）50mmol/LTris-HCl,50mmol/LNa2EDTA，SDS30g/L，使用HCl或NaOH调节pH蛋白酶K溶液20mg/mL蛋白酶K，无菌水溶解，-20℃保存，避免反复冻融10%SDS（pH7.2）100g/LSDS，37℃去离子水加热溶解，使用HCl调节pH，室温保存饱和酚：三氯甲烷：异戊醇25:24:1(体积比)三氯甲烷：异戊醇24:1(体积比)TE缓冲液（pH8.0）10mmol/LTris-HCl,1mmol/LNa2EDTA，使用HCl或NaOH调节pH2×PfuPCRMasterMix0.05U/μLPfuDNAPolymerase，0.4mmol/LdNTPs，4mmol/LMgCl2限制性内切酶HhaI10×Mbuffer100mmol/LTris-HCl（pH7.5），100mmol/LMgCl2，10mmol/LDithiothreito，500mmol/LNaCl5×TBE缓冲液54.0gTris碱，27.5g硼酸，0.5mmol/LEDTA20mL（pH8.0），加双蒸水定容至1L，使用时10倍稀释6×上样缓冲液0.25%（W/V）溴酚蓝，50%（V/V）甘油溶液DNA分子质量标准品100bpDNAMarker，DL2000DNAMarker，浓度50-100ng/μL溴化乙锭（EB）溶液1mg/mLDB21/T2548—20156附录B（规范性附录）种猪基因组DNA提取方法B.1组织消化将需要提取DNA的耳组织剪碎（无肉眼可见颗粒状组织）置于1.5mLEP管中，加入400μL裂解液、10%SDS200μL，蛋白酶K10μL，混匀置于56℃金属浴过夜。B.2DNA提取a)取出金属浴内的样品管，凉至室温，4℃，12000r/min，离心10min；b)取上清液至新的EP管中，加入等体积的饱和酚，颠倒混匀10min；c)4℃，12000r/min，离心10min；d)取上清液至新的EP管中，加入等体积的饱和酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀10min；e)4℃，12000r/min，离心10min；f)取上清液至新的EP管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀10min；g)4℃，12000r/min，离心10min；h)取上清液至新的EP管中，加入2.5倍体积的冰无水乙醇，轻柔混匀，置-20℃冰箱中放置30min。i)4℃，12000r/min，离心20min；j)弃上清液，加入1mL75%酒精漂洗，4℃，12000r/min，离心10min（此步骤重复2次）；k)4℃，12000r/min，离心20min；l)弃上清液，使管内酒精挥发干净；根据沉淀情况加入适量（建议40μL）TE缓冲液溶解，-20℃保存。B.3DNA含量的测定样品中提取的DNA含量测定用核酸蛋白测定仪进行测定。取适量DNA溶液加TE缓冲液进行稀释，分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280，DNA的浓度按式（1）计算：c=A×N×50/1000(1)式中：c——DNA浓度，μg/μL；A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。当A260/A280比值处于在1.4～2.0之间时，即可用于PCR扩增。DB21/T2548—20157附录C（规范性附录）种猪氟烷基因PCR扩增产物及酶切产物电泳图图C.1种猪氟烷基因PCR扩增结果图注：M为100bpDNAMarker，泳道1～5为检测样品图C.2种猪氟烷基因型检测结果图注：M为DL2000DNAMarker，泳道1～17为检测样品，其中泳道1、2和17为HalNHaln基因型，泳道3～15为HalNHalN基因型，泳道16为HalnHaln基因型_____________________________