DB32∕T 1730-2011 养殖水体细菌总数测定—荧光显微计数法

ICS65.150B50备案号：江苏省地方标准DB32/T1730—2011养殖水体细菌总数测定—荧光显微计数法Fluorescencemicroscopycountingmethodwasusedtomeasurethecountofaquaculturewaterbacteria2011-04-15发布2011-06-15实施江苏省质量技术监督局发布DB32DB32DB32DB32DB32/T1730—2011前言本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。本标准的附录A为资料性附录。本标准由江苏省海洋与渔业局提出。本标准起草单位：江苏省淡水水产研究所。本标准主要起草人：杨鸢劼、陈大鹏。DB32/T1730—20111养殖水体细菌总数测定--荧光显微计数法1范围本标准规定了荧光显微计数法测定养殖水体细菌总数的试剂、仪器设备、操作步骤、计数方法和计算。本标准适用于养殖水体细菌总数的测定，也适用于环境水域。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品卫生微生物学检验、染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3原理细菌组织细胞经阳离子荧光探针--吖啶橙（AcridineOrange，AO）荧光色素染色后，以嵌入或静电吸引与蛋白DNA/RNA相结合。在生物荧光显微镜高压汞灯发射光谱激发光下（200~600nm），活菌细胞和受损细胞（死细胞）分别产生黄绿色到绿色荧光和橙色到红色荧光。镜检计数待检样品中活菌细胞和死菌细胞数，同时也可以计数总菌数。4试剂所用试剂除特别说明外，药品均为分析纯(AR)。无菌水均为经0.2μm滤膜过滤的双蒸去离子水，符合Ⅰ级水的规格。4.1甲醛溶液(40%)4.2萘啶酮酸萘啶酮酸萘啶酮酸萘啶酮酸溶液（0.002%）萘啶酮酸（C12H12N2O3）0.002g无菌水100mL待萘啶酮酸充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌试剂瓶室温保存。4.3酵母膏酵母膏酵母膏酵母膏溶液（0.025%）酵母膏（生化试剂）0.025g无菌水100mL将酵母膏在无菌水中加热，充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌试剂瓶室温保存。4.4氢氧化钠溶液（4%）氢氧化钠（NaOH）4g无菌水100mLDB32/T1730—201124.5磷酸盐缓冲液（pH7.2±0.05）磷酸二氢钾（KH2PO4·2H2O）34g无菌水500mL待磷酸二氢钾充分溶解后，用NaOH溶液调整pH7.2±0.05，4℃保存。4.6吖啶橙染色溶液（0.1%）吖啶橙（C17H19N3·HCl·0.5ZnCll2）10mg磷酸盐缓冲液（pH7.2±0.05）100mL将吖啶橙和磷酸盐缓冲液混合，充分溶解后，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置灭菌棕色试剂瓶，室温保存，有效期6个月。操作时需戴手套。4.7苏丹黑B溶液苏丹黑B（C29H24N6）100mg无水乙醇（C2H6O）75mL无菌水75mL将苏丹黑B在乙醇中充分溶解后，再与无菌水混合，经0.2μm滤膜过滤灭菌，置棕色试剂瓶暗处保存，有效期6个月。4.80.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0～9.5)碳酸氢钠（NaHCO3）3.7g碳酸钠（Na2CO3）0.6g无菌水600mL将碳酸氢钠和碳酸钠在无菌水中充分溶解后置试剂瓶，密封保存。4.9缓冲甘油封片剂碳酸盐缓冲液(pH9.0-9.5)10mL无荧光甘油（C3H8O3）90mL按比例将碳酸盐缓冲液和无荧光甘油在搅拌器上充分混匀后4℃保存，待气泡排除后方可使用。4.10无荧光显微镜物镜镜油TypeFF（Nd=1.516）5仪器及设备5.1荧光显微镜，具落射汞灯装置、摄像转换器及监视器,滤光片组：450～490nm激发，520nm屏障，目镜（10×），油镜物镜（100×）。5.2电子天平：感量0.0001g。5.3电位pH计。5.4超净工作台。5.5高压灭菌锅。5.6采样瓶，50mL螺盖聚丙烯塑料瓶。5.7醋酸纤维滤膜：ø25mm，孔径0.22μm。5.8过滤器（包含抽滤管）。5.9量筒（容量20mL）。5.10镊子（平头）。5.11酒精灯。5.12载玻片：25.4mm×76.2mm(长×宽)，厚0.80mm。5.13盖玻片：18.0mm×18.0mm(长×宽)，厚0.17mm。DB32/T1730—201136测定步骤6.1准备6.1.1采样瓶使用前用5%HCl溶液浸泡1h以上，0.2μm滤膜过滤的双蒸去离子水漱洗。6.1.2采样瓶密闭包装后置高压灭菌锅，1.05kg/cm2（121.3℃），保持20min，冷却后，无菌室保存备用。6.1.3醋酸纤维滤膜用苏丹黑B溶液浸泡24h，消除滤膜自发荧光。6.1.4处理过的醋酸纤维滤膜平整放置于滤器底座。6.1.5安装过滤器和抽滤管，用经过处理的无菌水加满抽滤管，缓慢抽滤清洗3次后，备用。6.2样品处理6.2.1取待检水样50mL于灭菌采样瓶中，采样时不需要水样冲洗采样瓶。6.2.2如果待检水样不能立即进行细菌计数，可在水样中加入1:20（V:V）甲醛溶液，至甲醛终浓度为2%，可在4℃保存1个月。6.3水样检测制片制备6.3.1取固定后的水样1mL，使用抽滤装置，缓慢释放真空过滤。6.3.2无菌吸取吖啶橙染液3mL，充分覆盖滤膜，缓慢释放真空过滤染色3~5min。6.3.3移走滤器，空气干燥15s，用灭菌镊子取下滤膜。6.3.4在洁净的载玻片上加1小滴无荧光镜油，贴上滤膜，滤膜载菌面朝上。6.3.5在盖玻片上加1小滴无荧光镜油，具油面朝下盖紧滤膜，用镊子轻压盖紧滤膜，滤膜上下两面放置不能有气泡。6.3.6用封片剂将盖玻片4周封固，用于计数。如不能立即计数，可将制片在-20℃条件下保存2~3周。6.4计数和结果判断6.4.1使用落射光荧光显微镜，蓝色激光道，紫外光波长450nm。6.4.2镜检计数视野中的荧光菌体，发黄绿色到绿色荧光为活菌体细胞，发橙色到红色荧光为死亡菌体细胞。6.4.3计数10个随机视野，每个视野菌数为50~300cells为好，求平均值。若视野中菌数远大于300cells，则将待检水样用生理盐水稀释后重新过滤染色，再进行计数。6.4.4每次测定计数时，应使用无菌水为阴性对照，作为控制样品处理过程中污染进入的颗粒干扰，每个视野不得出现1个以上细菌。7计数依据样品中细菌菌落计数，按下式（１）计算每升水样中的细菌菌落总数。BN=VSfSNa×−××)05.01(·······························（1）式中：BN—样品含菌数，单位为个每升（cells/L）；Na—各视野平均菌数，单位为个（cells）；S—滤膜实际过滤面积，单位为平方毫米（mm2）；Sf—显微镜视野面积，单位为平方毫米（mm2）；V—过滤样品量，单位为升（L）；DB32/T1730—201140.05—加入甲醛溶液占固定样品总体积的比例。8注意事项8.1水体和溶液中的细菌或其他荧光颗粒可干扰计数的准确性，除待检测样品外，其他测定过程中使用的试剂和溶液都应当用0.2μm滤膜过滤，所有玻璃器皿都须用0.2μm滤膜过滤后双蒸去离子水冲洗。8.2荧光显微镜蓝色激发光道、油镜条件下，病毒颗粒呈针扎状、亮绿色，细菌细胞亦呈亮绿色，但其亮度强于病毒颗粒，且菌体比病毒颗粒大得多。8.3每次测定计数时，使用无菌水为阴性对照，控制样品处理过程中污染进入的颗粒干扰，每个视野不得出现1cell以上细菌。8.4因二甲苯能自发荧光，封片剂和物镜清洁绝不能使用二甲苯。8.5开启汞灯后，不可立即关闭，一次工作最少15～20min，灯熄灭后要等待30min，完全冷却后才能重新启动。DB32/T1730—20115江苏省地方标准江苏省地方标准江苏省地方标准江苏省地方标准《《《《养殖水体细菌总数测定养殖水体细菌总数测定养殖水体细菌总数测定养殖水体细菌总数测定--------荧光显微计数法荧光显微计数法荧光显微计数法荧光显微计数法》》》》编编编编制制制制说说说说明明明明一、标准编写背景养殖水体中的细菌主要来源于土壤、养殖动物排泄物、残饵和水生动植物腐尸等。大多数细菌对养殖水生动物是无害的，起分解残体、储存转化养分、降解污染物等作用，使养殖水体得到净化，与水体环境及宿主相互作用构成统一的生态体系。在水生动物高密度的人工养殖过程中，饵料投喂、各类药物投放等因素，造成水体环境的高负荷，人为因素干扰着水体中细菌的均衡繁殖。养殖水体中细菌含量的大量增加，不仅影响水体质量，而且直接关系到水体的应用价值、生态环境、水产品的无公害养殖和人类健康，有害细菌的大量繁殖还将导致养殖水生动物病害的发生。长期以来，对水体细菌的计数方法主要采用物理法（常用于总菌落计数，如显微镜直接计数法、直接涂片计数法、比浊计数法等）和生物学法（常用于活菌计数，如平板培养计数法，最近似数测定法，还原计数法等）。目前国内测定水体细菌总数的检测标准（GB/T5750.12-2006）《生活饮用水标准检验方法微生物指标》，实施的检测方法为平皿计数法，报告方式为细菌菌落总数（CFU/mL）。养殖水体中细菌种类繁多，对营养和生长条件的要求差别很大，培养条件（培养基、pH值、温度、气体条件等）不可能对任何一种细菌生长繁殖都适合，仅有1％的细菌可通过传统的培养方法在培养基上得到培养，绝大多数细菌要求非常严格的营养条件或难以培养。以培养基平皿上生长出来的菌落，仅是水体细菌总数的近似值。有的菌落可能是由多个细菌形成的，用平皿培养法得到的结果往往小于实际值，而且任何污染都会造成错误结果。计数时形成的菌落并不完全是一个细菌形成的，样品中的细菌通常以团块状或链条状排列存在，特别在繁殖活跃期往往集聚成团，在稀释样品时也不能将其完全分开。因此，无论应用何种方法进行细菌的检测都存在着局限性，尤其对处于休眠状态和死亡细菌的检测难度更大。为此，建立一种快速、准确、灵敏的水体细菌总数测定方法，对实时监测和有效调节养殖水体环境细菌数量，加强养殖水生动物的质量管理，提高养殖水生动物质量安全具有极为重要的现实意义，也是污染控制、污水处理、水生动物疾病预防与控制的迫切需要。DB32/T1730—20116二、任务来源江苏省质量技术监督局于2009年5月文下达了《关于下达2009年度江苏省农业地方标准制定项目及经费指标的通知》（苏质监标发[2009]132号）。《通知》中《养殖水体细菌（G-）菌落总数测定--荧光显微计数法》，由江苏省海洋与渔业局提出，江苏省淡水水产研究所负责制订。三、主要工作过程标准编写组围绕标准的制订进行了大量实验数据的整理分析工作，查阅了国内外有关文献资料和相关标准。目前国内检测水体细菌总数的执行标准为（GB/T5750.12-2006）《生活饮用水标准检验方法微生物指标》。在现有国际、国内和相关行业对水体细菌总数检测工作的基础上，结合大量实验数据，制订了《养殖水体细菌总数测定--荧光显微计数法》征求意见稿。在对标准验证过程中，取养殖水体样本5个（n=5），2个实验室分别进行细菌总数检测，检测率不底于105cell/mL。综合验证检测数据，2个实验室对5个样本细菌总数测定的平均数分别为5.29×105和4.52×105cell/mL，总精度分别为0.58×105和0.75×105cell/mL，单个操作员平均精度分别为0.43×105和0.56×105cell/mL。2009年11月将征求意见稿函送有关专家修改，汇总专家意见，形成送审稿。四、标准起草人员及所做的工作标准起草人员杨鸢劼、陈大鹏。负责项目的总体规划和本标准的起草、编制说明的编写及征求意见稿的发送、专家意见汇总、修改工作等。五、标准编制依据及原则随着生命科学研究的快速发展，生物荧光技术在微生物学研究领域的应用已成为生命科学研究的重要手段之一。应用荧光色素和细胞内某种特定成分的结合