DB32∕T 1774-2011 鸭H9 亚型禽流感病毒与副粘病毒的检测双重RT-PCR 方法

ICS65.020.30B41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1774—2011鸭H9亚型禽流感病毒与副粘病毒的检测双重RT-PCR方法MethodofMultiplexRT-PCRdetectingH9SubtypeAvianInfluenzaVirus(AIV)andDuckParamyxovirus(DPV)2011-05-06发布2011-07-06实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1774—2011I前言为规范鸭H9亚型禽流感病毒与鸭副粘病毒双重RT-PCR分子生物学检测技术，提高两种病毒混合感染检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准结构和编写规则》编制。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：魏雪涛、李银、刘宇卓、张敬峰。DB32/T1774—20111鸭H9亚型禽流感病毒与副粘病毒的检测双重RT-PCR方法1范围本标准规范了鸭H9亚型禽流感病毒与副粘病毒分子生物学检测技术RT-PCR的所用引物大小、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于鸭H9亚型禽流感病毒与副粘病毒单独或者混合感染的实验室诊断、临床诊断、流行病学调查、分离毒株的鉴定，适用于鸭组织、分泌物、排泄物和鸭胚尿囊液中H9亚型禽流感病毒和副粘病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法NY/T772-2004禽流感病毒RT-PCR试验方法3原理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术却以其快速、敏感和特异等优点在动物疫病检测中得到广泛应用，而且随着PCR技术的不断改进，这种针对病原核酸的诊断方法表现出更准确、灵敏和特异的特点。又因为双重RT-PCR技术具备1次PCR可以鉴别诊断2种混合感染的不同病原体的独特优势，现已成为动物病原检测的重要方法之一。本标准参考了NY/T772-2004中H9AIV的检测方法，并根据GenBank上公布的鸭副粘病毒（DPV）血凝素HA基因序列的保守序列设计一对特异性引物，保证了扩增的准确性，该方法可以同时鉴定两种病毒的单一感染和混合感染。4仪器设备与主要试剂4.1仪器设备：PCR仪，离心机，电泳槽，微量移液器，凝胶成像仪4.2主要试剂：TRIZOL，氯仿，异丙醇，无水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水，AMV反转录酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，RNA酶抑制剂，25mmol/LMgCl2，EXTaqDNA聚合酶，10×EXTaqDNA聚合酶buffer，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，琼脂糖。5引物5.1反转录引物H9AIV：5′-AGCAAAAGCAGG-3′DPV：5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3′DB32/T1774—201125.2PCR扩增引物H9AIV:上游引物：5′-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3′；下游引物：5′-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3′。DPV：上游引物：5′-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3′；下游引物：5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3′6样品采集按照NY/T541-2002，病死或扑杀鸭，取鸭肺脏、脾脏等组织；待检活鸭用棉拭子蘸取气管分泌物或者泄殖腔排泄物，置于50%甘油生理盐水中。阴性对照：没有发病的正常鸭肺脏、脾脏等组织阳性对照：用阳性抗体进行血凝抑制试验检测的阳性尿囊液7方法步骤试验用水：按照GB-T6682-2008三级水标准。7.1样品处理取待检病料0.5g～1g置研钵中剪碎并研磨，反复冻融研磨，将研磨好的组织用生理盐水1︰5稀释，稀释液12000r/min离心10min，取上清200µL备用。分泌物和排泄物样品的处理，将喉拭子或者泄殖腔拭子在50%甘油生理盐水中充分捻动、挤干后弃去拭子，4℃12000r/min离心10min，取上清200µL备用。7.2病毒RNA的提取取已处理的待检样品，以含H9亚型AIV、DPV和两种病毒混合液为阳性对照,以正常SPF鸡胚尿囊液为阴性对照，无菌水为空白对照，每管依次加入Trizol800µL，振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿200µL，剧烈振荡后，室温放置1min，4℃12000r/min，离心15min，取上层水相750µL，加入500µL异丙醇，混匀，-20℃放置15min，4℃10000r/min离心10min，去上清，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，4℃8000r/min离心5min，去上清，室温干燥20min，加入DEPC水10µL，使充分溶解。7.3RT-PCR反转录反应：5×AMVBuffer4μL、10mmol/LdNTPs2μL、两种下游引物各1μL、RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板10μL，AMV反转录酶0.5μL，H2O（DEPC处理）1μL，总体积为20μL，瞬间离心混匀，65℃反应15min，42℃孵育1h，95℃5min，同时设立阴性、阳性对照，产物于-20℃保存备用。PCR的反应：按25µL体系进行，含MgCl2（25mmol/L）1.5µL，灭菌水14µL，反转录产物4µL，10×EXTaqDNA聚合酶buffer2.5µL，10mmol/LdNTPs0.5µL，50pmol/µL两种上、下游引物各0.5µL，EXTaqDNA聚合酶0.5µL。94℃3min，然后进入循环94℃30s，54℃30s，72℃30s，30个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。7.4结果观察将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30min，紫外灯下观察结果，并进行拍照。DB32/T1774—201138结果判定在阳性对照出现相应扩增带、阴性对照无此扩增带是判定结果。被检样品出现732bp条带时，判定H9亚型禽流感病毒核酸阳性；被检样品出现363bp条带时，判定副粘病毒核酸阳性；被检样品同时出现732bp、363bp条带时，判定H9亚型禽流感病毒和副粘病毒均核酸阳性；如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要重复；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要重复。