DB37T 2292-2013 刺参(种质)

ICS65.150B51DB37山东省地方标准DB37/T2292—2013刺参（种质）2013-04-01发布2013-05-01实施山东省质量技术监督局发布DB37/T2292—2013I前  言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省海洋水产研究所。本标准主要起草人：孙国华、刘丽娟、任利华、姜向阳、宋秀凯、孙伟、姜会超。DB37/XXXXX—XXXX1刺参（种质）1范围本标准规定了刺参（Apostichopusjaponicus）的名称与分类、主要形态特征、生长与繁殖、分子遗传学特性及检测方法。本标准适用于刺参的种质检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.1养殖鱼类种质检验第1部分检验规则GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分抽样方法3名称与分类3.1学名刺参（Apostichopusjaponicus）。3.2分类棘皮动物门(Echinodermata)，海参纲（Holothuroidea），楯手目（Aspidochirota），刺参科（Stichopodidae），仿刺参属（Apostichopus）。4主要形态特征4.1外部形态特征4.1.1体呈扁的圆筒形，两端稍细，横断面略呈四角形。成参体长一般20cm～40cm。口在前端，偏于腹面，肛门在后端，偏于背面。口周生有20个楯状触手。背、侧面有大小不一、排列不规则的4列纵向肉刺。体色呈黄褐、黑褐、绿褐、纯白或灰白等。体壁分为5个步带区和5个间步带区，彼此相间排列。腹面平坦，管足密集，排成不规则的3条纵带。4.1.2刺参外部形态见图1。DB37/XXXXX—XXXX2图1刺参外部形态4.2内部构造特征4.2.1体壁由角质层、表皮、结缔组织和无数小型骨片组成。4.2.2肌肉层由环肌和纵肌组成，外层为环肌，内层为纵肌，纵肌5束。4.2.3消化系统由口、咽、食道、胃、肠和排泄腔组成。4.2.4循环系统由血管、血窦和围血系统组成，血液透明呈淡褐色。4.2.5石灰环咽部周围有由5个辐片和5个间辐片构成的石灰环。4.2.6波里氏囊体内具有一呈圆形、卵圆形或长瓶形的波里氏囊。5生长与繁殖5.1生长通常在人工养殖条件下不同年龄组刺参的体长和体重情况见表1。表1不同年龄组刺参全长和体重的实测值年龄，龄12345体长，mm42～7892～164156～230196～274205～346体重，g7.4～25.778.4～255.2238.1～453.5343.9～565.6384.9～561.05.2繁殖DB37/XXXXX—XXXX35.2.1性成熟年龄刺参雌雄异体，雌性和雄性个体均在2龄左右性成熟。5.2.2性腺发育周期刺参的生殖周期为一个周年，分为以下5个周期：a)休止期：性腺呈透明细丝状，量极少；b)增殖期：性腺多呈无色透明或淡黄色；c)生长期：包括发育1期和2期。发育1期性腺逐渐增粗，分支增多，呈杏黄或浅橘红色。发育2期性腺迅速发育，颜色变深，雌雄明显可辨；d)成熟期：精巢呈乳黄色，卵巢呈橘红色、半透明状，卵粒清晰可见；e)排放期：出现自然排精、产卵现象。排放期后性腺退化进入休止期。5.2.3产卵量成熟雌参可排卵1次～3次，可持续30min以上，产卵量一般在100万粒～200万粒，大个体可超1000万粒。6分子遗传学特性6.1微卫星位点6.1.1刺参群体30个个体中5个微卫星位点PCR扩增多态图谱见图2、图3、图4、图5和图6，微卫星位点扩增引物及条件见7.3.1。图2微卫星位点Ajssr01扩增图谱图3微卫星位点Ajssr02扩增图谱DB37/XXXXX—XXXX4图4微卫星位点Ajssr03扩增图谱图5微卫星位点Ajssr04扩增图谱图6微卫星位点Ajssr05扩增图谱6.1.25对微卫星引物在刺参群体中共扩增获得23个等位基因，每个微卫星座位检测到的等位基因数为3个～7个。群体的观测杂合度的平均值为0.4759，多态信息含量平均值为0.52493。6.216SrRNA序列6.2.1采用PCR技术对刺参线粒体16SrRNA(核糖体16SrRNA)基因片段进行PCR扩增，引物序列见7.3.2.2，并将获得序列进行测序，获得以下长度为570bp的核苷酸序列：TCGCCTTGGTTTACAAAAACATAGCCCCACGAACTTCATATGTGGGGTGCAGCCTGCCCAGTGGAATTTATTCTAAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCAAAGGTAGCATAATCACTTGTCTCTTAAATGGGGACCTGTATGAATGGCTTTTCACTCTTTCACTGTCTCTCTTCCCTCCCTCCTAATCTTCTAATCACGTGAAGAAGCGTGAACAAATAAGAAAGACGAGAAGACCCTGTCGAGCTTAAGCTAACCCTGAAATGTCGTCTACCTTTTTTCTTAGAAAGAGGTAAATTTCAGATAAAGTTTTGGTTGGGGCAACCGTGGAGAAAAAGAATCCTCCAGTTAGTTAGGAAGAAAACCTTTCACCTAAAAAATTTAGCGACCCAGTTACTCTGGTAAACGGAAAAAGTTACCGCAGGGATAACAGCGTTATCTTCTCTAAGAGCCCATATTGACGAGAAGGATTGCGACCTCGATGTTGGATTGGGGTAACCAAAGGGTGTAGCAGCTCTTTAAGGTTGGACTGTTCGTCCATTAACTCCCTACATGATCTGAGTTCAAAACCGGA。7检测方法DB37/XXXXX—XXXX57.1抽样按照GB/T18654.2规定执行。7.2体长、体重检验方法暂养于的干净海水中30min以上，在无刺激自然伸展状态下测量刺参头至尾为体长；刺参从海水中捞出，静置10min且排出腹腔大量海水后，以吸水滤纸除去表面水分，称量刺参体重。7.3分子遗传学特性分析7.3.1微卫星位点分析7.3.1.1DNA的提取取纵肌100mg剪碎后，放入600μL裂解液，55℃水浴消化至组织、碎块完全裂解。裂解液分别用等体积的饱和酚、酚：三氯甲烷(1：1)、三氯甲烷：异戊醇(24：1)抽提，加入2倍体积的无水乙醇和终浓度10%的乙酸钠离心沉淀DNA，最后用70%的乙醇洗2次后晾干。裂解液配方见附录A。7.3.1.2微卫星位点引物序列微卫星位点引物序列见表2。表2微卫星位点引物序列序列号引物序列Ajssr01F:TGCAACGTTGATGTCATGAGCR:GAGACCTAGGCACTATAATTCCAjssr02F:ACTTGCTACTTTGTTCAACTGCR:GGAGGTACAAAAGAAAGACAGGAjssr03F:CAAACGCATACAATTACACAR:CGATCGATAGTCCTCAATCAjssr04F:GCAGGAGGATCTAAAATACATR:ATCGAACACAACACAACACTTATC7.3.1.3反应条件95℃预变性6min；94℃变性50s，54℃退火温度反应50s，72℃延伸50s，30个循环；之后72℃5min，4℃保温。反应液配方见附录A。7.3.1.4电泳检测扩增产物经10%(w/v)聚丙烯酰胺凝胶电泳（恒功率60W），硝酸银染色并检测其多态性。聚丙烯酰胺凝胶及染色液配方见附录B。7.3.2线粒体16SrRNA序列7.3.2.1DNA的提取同7.3.1.1。7.3.2.2引物序列DB37/XXXXX—XXXX616Sf：5'-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3'；16Sr：5'-CCGGTCTAGACTCAGATCATG-3'。7.3.2.3反应条件以提取的DNA为模板，利用两个特异性引物进行PCR扩增。PCR反应条件如下：94℃变性2min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环。反应液配方见附录B。7.3.2.4片段回收、纯化与序列测定PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化目的片段，用基因自动分析仪测序，反应程序按照所使用的测序试剂盒说明书给出的规程操作，最后读出16SrDNA的序列。7.4检验规则与结果判定参照GB/T18654.1的规定执行。DB37/XXXXX—XXXX7AA附录A（规范性附录）DNA提取裂解液和PCR扩增反应液组成A.1DNA提取裂解液DNA提取裂解液配制方法见表A.1。表A.1DNA提取液配制方法名称剂量HB(10mmol/LTris-HCl,pH8.0；100mmol/LEDTA)540μLSDS(十二烷基磺酸钠)(10%)60μL蛋白酶K100μgA.2扩增PCR反应液扩增PCR反应液配制方法见表A.2。表A.2扩增PCR反应液配制方法名称剂量DNA模板50ng～100ng10倍扩增缓冲液2.5μLMgCl2(25mmol/L)2.0μLdNTP(10mmol/L)O.5μL引物f(50pmol/μL)0.5μL引物r(50pmol/μL)0.5μLTaq酶(5U/μL)0.2μL超纯水配制成25μL的反应体系DB37/XXXXX—XXXX8BB附录B（规范性附录）聚丙烯酰胺凝胶及银染液配方B.15倍TBE缓冲液5倍TBE缓冲液配制方法见表B.1。表B.15倍TBE缓冲液配制方法名称剂量Tris碱50ng～100ng硼酸2.5μLEDTA2.0μL超纯水定容至1L4℃保存备用。B.210%过硫酸铵溶液（APS）10%过硫酸铵溶液（APS）配制方法见表B.2。表B.210%过硫酸铵溶液（APS）配制方法名称剂量过硫酸铵2g超纯水20mL溶解后分装成小管，每管500uL，-20℃保存。B.310%聚丙烯酰胺凝胶的配制（现配现用）10%聚丙烯酰胺凝胶配制方法见表B.3。表B.310%聚丙烯酰胺凝胶配制方法名称剂量5倍TBE5mlAPS(10%)250ul超纯水12.5ml丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺母液（29:1）7.5mlTEMED25ulB.4银染液的配制（使用前10min配制）银染液配制方法见表B.4。DB37/XXXXX—XXXX9表B.4银染液配制方法名称剂量硝酸银（AgNO3）1g37%甲醛3mL超纯水定容至1L_________________________________