DB32∕T 2447-2013 马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术操作规程

ICS65.020.30B41备案号：41148-2014DB32江苏省地方标准DB32/T2447—2013马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术操作规程DiagnosticTechniquesofIFAforMarek’sDisease2013-12-30发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2447—2013I前言本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求编制而成。本标准由扬州大学提出。本标准由扬州大学兽医学院起草。本标准主要起草人：金文杰、秦爱建、崔治中、殷俊、张鑫宇、刘岳龙、邵红霞。DB32/T2447—20131马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术操作规程1范围本标准规定了马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术中被检家禽外周血液单核细胞（PBMCs）的制备、用特异性抗体做间接免疫荧光检测待检PBMCs感染的病毒。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3被检家禽外周血液单核细胞（PBMCs）的制备3.1待检样品的采集按照抗凝剂与血液1:9，新鲜采集18日龄以上待检家禽的抗凝血，抗凝剂配制见附录A。3.2外周血液单核细胞（PBMCs）的制备将抗凝血缓缓加入装有市售的淋巴细胞分层液的试管中，使血液重叠于分层液上，用水平转子离心机2000转每分钟离心30分钟。用毛细管吸取PBMCs层，置离心管中，用PBS（pH7.2、0.01mol/L，下同，配制见附录B）以1000转每分钟离心10分钟洗涤1-2次，用PBS配成细胞悬液（约107个/毫升）。4用特异性抗体做间接免疫荧光检测待检PBMCs感染的病毒4.1抗MDV特异性抗体作为第一抗体，采用抗MDVgB单克隆抗体BA4和BD8（扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室制备保存）。4.2FITC标记抗体由于第一抗体为MDV特异性单克隆抗体，所以选用市售的FITC标记的抗小鼠IgG山羊血清作为第二抗体。4.3悬浮法间接免疫荧光操作过程a)在1.5毫升离心管中加入100微升单细胞悬液，再加入100微升第一抗体，混匀，37℃作用45分钟；b)将细胞重新悬浮于1毫升PBS中，以1000转每分钟离心5分钟洗涤，重复一次；c)以100微升PBS重新悬浮，加100微升FITC标记羊抗鼠IgG抗体，置37℃作用45分钟；DB32/T2447—20132d)将细胞重新悬浮于1毫升PBS中，以1000转每分钟离心5分钟洗涤，重复一次，最后一次离心去上清备用；e)将细胞重新悬浮于20-30微升含10%甘油的PBS中，滴加于载玻片上，加盖玻片封片，立即用倒置荧光显微镜观察。4.4结果的判定被感染的PBMCs细胞内呈现黄绿色荧光，周围未被感染的细胞不被着色或颜色很淡。在放大200X或400X时，可见被感染细胞核着色，未被感染的细胞不着色但可显出细胞轮廓。DB32/T2447—20133AA附录A（规范性附录）抗凝剂的配制肝素溶液：加生理盐水将肝素粉稀释成每毫升200单位，贮存备用，采血时使每毫升含肝素15-20单位。DB32/T2447—20134BB附录B（规范性附录）pH7.2、0.01mol/LPBS的配制PBS配制步骤：a)配制25×PB:称取2.74g磷酸氢二钠和0.79g磷酸二氢钠加蒸馏水至100mL;b)配制1×PBS:量取40mL25×PB,加入8.5g氯化钠,加蒸馏水至1000mL;c)用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2;d)高压蒸汽灭菌或过滤除菌;e)PBS一经使用,于4℃保存不超过3周。_________________________________