DB11T 1053.1-2013 实验用鱼 第1部分微生物学等级及监测

ICS65.020.30B44备案号:40366-2014DB11北京市地方标准DB11/T1053.1—2013实验用鱼第1部分：微生物学等级及监测LaboratoryfishPart1：Microbiologicalstandardsandmonitoring2013-12-20发布2014-04-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T1053.1—2013I目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14微生物学等级分类...................................................................15检测项目...........................................................................26检测程序...........................................................................27检测要求...........................................................................38检测方法...........................................................................49结果判定...........................................................................6DB11/T1053.1—2013II前言DB11/T1053的本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。DB11/T1053《实验用鱼》分为六个部分：——第1部分：微生物学等级及监测；——第2部分：寄生虫学等级及监测；——第3部分：遗传质量控制；——第4部分：病理学诊断规范；——第5部分：配合饲料技术要求；——第6部分：环境条件。本部分为DB11/T1053的第1部分。本部分由北京市科学技术委员会提出。本部分由北京市科学技术委员会归口。本部分由北京市科学技术委员会组织实施。本部分起草单位：国家人口计生委科学技术研究所、中国科学院水生生物研究所、中国食品药品检定研究院。本部分主要起草人：李爱华、崔宗斌、孙德明、岳秉飞、王天奇。DB11/T1053.1—20131实验用鱼第1部分：微生物学等级及监测1范围DB11/T1053的本部分规定了实验用鱼（斑马鱼和剑尾鱼）微生物学等级及监测，包括普通级(CV)和无特定病原体级(SPF)实验用鱼的微生物等级分类、检测要求、检测程序、检测方案、检测方法、结果判定和报告等。本部分适于实验用鱼（斑马鱼和剑尾鱼）的微生物学等级划分和质量监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.7食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验GB4789.15食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数GB/T14926.15实验动物肺炎链球菌检测方法GB/T14926.16实验动物乙型溶血性链球菌检测方法GB/T18652致病性嗜水气单胞菌检验方法SC/T7201.2鱼类细菌病检疫技术规程第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法SC/T7201.3鱼类细菌病检疫技术规程第3部分：嗜水气单胞菌及豚鼠气单胞菌肠炎病诊断方法SC/T7201.4鱼类细菌病检疫技术规程第4部分：荧光假单胞菌赤皮病诊断方法SN/T1869食品中多种致病细菌快速检测方法PCR法SN/T2439鱼鳃霉病检疫技术规范《斑马鱼疾病健康手册》2012年4月24日国际斑马鱼资源中心(ZIRCHealthServicesZebrafishDiseaseManual,M.L.Kent,J.M.Spitsbergen,J.M.Matthews,J.W.Fournie,K.N.MurrayandM.Westerfield)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实验用鱼laboratoryfish经人工饲养、繁育，对其携带的病原微生物及寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的鱼类。4微生物学等级分类DB11/T1053.1—201324.1普通级实验用鱼conventional(CV)laboratoryfish不携带所规定的鱼的烈性传染病病原和与人共患病的病原。4.2无特定病原体级实验用鱼specificpathogenfree(SPF)laboratoryfish除了普通级应排除的病原体外，不携带所规定的对实验用鱼危害大、重要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原体。5检测项目5.1外观检查外观健康、无异常。5.2微生物学检测项目普通级(CV)和无特定病原体级(SPF)实验用鱼病原微生物检测项目见表1。表1CV和SPF实验用鱼病原微生物检测项目等级应排除的病原微生物检测要求无特定病原体级普通级海分枝杆菌Mycobacteriummarinum龟分枝杆菌Mycobacteriumchelonae脓肿分枝杆菌Mycobacteriumabscessus嗜血分枝杆菌Mycobacteriumhaemophilum霍乱弧菌Vibriocholerae嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila海豚链球菌Streptococcusiniae●●●●●●○柱状黄杆菌Flavobacteriumcolummare维隆尼气单胞菌Aeromonasveronii简氏气单胞菌Aeromonasjandaei偶发分枝杆菌Mycobacteriumfortuitum水霉菌Saprolegniaspp.鳃霉菌Branchiomycesspp.嗜鳃黄杆菌Flavobacteriumbranchiophilum嗜冷黄杆菌Flavobacteriumpsychrophilum荧光假单胞菌Pseudomonasspp.温和气单胞菌Aeromonassobri链球菌Streptococcusspp*●●●●●●○○○○○注1：●必须检测项目：指在进行实验用鱼质量评价时必须检测的项目。○必要时检测项目：指引进实验用鱼时或怀疑本病流行等必要时要求检测的项目。注2：*指海豚链球菌之外的链球菌6检测程序检测程序见图1。DB11/T1053.1—20133抽样↓编号↓外观检查↓麻醉1)↓体表微生物学检查和取材↓剖检及体内微生物学检查和取材↓解剖镜和显微镜检查↓微生物学分离培养鉴定-----必要时取水样↓检测结果↓检测报告图1微生物学检测程序7检测要求7.1检测频率每3个月至少检测1次。7.2样品要求7.2.1样品应为3月龄以上成鱼，必要时同时取饲养环境水样作为样品。7.2.2应在不同的水环境内随机抽样。7.2.3抽样采集样品数量，见表2。表2抽样采集样品数量同一水环境实验用鱼数量抽样数量100尾以下5尾100尾以上5%，最大取样量为30尾7.2.4采集的样品应新鲜，避免冰冻，避免人为污染和采样误差。每一样品要附有编号和标志并附送检单，写明样品的来源、品种品系、级别、数量、检测项目和采样时间。7.2.5样品采集：按照细菌、真菌的取样要求，与寄生虫学、病理学或遗传学等检测联合取样。1)活体实验用鱼的麻醉，应方便于检查、采样和满足动物福利伦理的要求。DB11/T1053.1—201347.2.6取样顺序：先做细菌、真菌接种，然后取样用于PCR检测，最后进行固定，用于组织学检查。7.3检测内容7.3.1外观检查：检查体表、鳃部和天然孔。7.3.2剖检检查：检查胸腔、腹腔内各器官。7.3.3解剖镜和显微镜检查：通过外部、剖检检查取样，利用组织印迹或组织涂片，采用适当方法染色后，观察是否有真菌、细菌等感染的存在。8检测方法8.1细菌和真菌的检测方法细菌和真菌的检测方法见表3。表3细菌和真菌的检测方法微生物检测方法海分枝杆菌抗酸染色（ZIRC）2)龟分枝杆菌抗酸染色（ZIRC）脓肿分枝杆菌抗酸染色（ZIRC）霍乱弧菌微生物分离培养（GB/T4789.7）海豚链球菌微生物分离培养（GB/T14926.15）链球菌微生物分离培养（GB/T14926.15及GB/T14926.16）嗜水气单胞菌微生物分离培养（SC/T7201.3）柱状黄杆菌微生物分离培养（SC/T7201.2）嗜鳃黄杆菌微生物分离培养（SC/T7201.2）嗜冷黄杆菌微生物分离培养（SC/T7201.2）荧光假单胞菌微生物分离培养（SC/T7201.4）维隆尼气单胞菌微生物分离培养（GB/T18652）简氏气单胞菌微生物分离培养（GB/T18652）偶发分枝杆菌抗酸染色（ZIRC）（2）嗜血分枝杆菌抗酸染色（ZIRC）（2）水霉菌微生物分离培养（GB4789.15）鳃霉菌微生物分离培养（SN/T2439）温和气单胞菌微生物分离培养（GB/T18652）8.2分枝杆菌的区分鉴定方法4种分枝杆菌的区分鉴定方法见表4。2)《斑马鱼疾病健康手册》2012年4月24日国际斑马鱼资源中心(ZIRCHealthServicesZebrafishDiseaseManual,M.L.Kent,J.M.Spitsbergen,J.M.Matthews,J.W.Fournie,K.N.MurrayandM.Westerfield)DB11/T1053.1—20135表44种分枝杆菌的区别鉴定方法*色素产生硝酸还原Tween-80水解50g/LNaCl生长耐热触酶（68℃20min）芳香硫酸酯酶尿素酶铁吸收生长速度偶发分枝杆菌-+±+++++速生龟分枝杆菌----+++-速生脓肿分枝杆菌---++++-速生海分枝杆菌光照后可产生色素-+-±±缓生注1：+：84%以上菌株阳性；-：少于16%阳性；±：50%～84%阳性。注2：*嗜血分枝杆菌采用种特异性引物进行PCR快速检测。8.3PCR检测方法按照SN/T1869进行细菌DNA提取、PCR扩增、电泳和结果分析。本部分中有关细菌的属或种特异性PCR扩增引物见表5。对扩增产物进行常规的分子克隆和测序比对。表5特异性PCR扩增引物序列和产物大小菌种或菌株引物名称和序列扩增产物大小Flavobacteriumspp.*AGRGTTTGATCMTGGCTCAGGGACCCTTTAAACCCAAG561bpFlavobacteriumColummareGCCCAGAGAAATTTGGATTGCGATTACTAGCGAATCC1193bpFlavobacteriumpsychrophilumAGAGTTTGATCATGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT1498bpF.psychrophilum巢式PCR引物GTTGGCATCAACACACTCGATCCTACTTGCGTAG1089bpMycobacteriumspp.*GCGAACGGGTGAGTAACACGTGCACACAGGCCACAAGGGA。924bpMycobacterium巢式PCR引物AATGGGCGCAAGCCTGATGACCGCTACACCAGGAAT300bpMycob