DB32∕T 2571-2013 鸡传染性支气管炎RT-LAMP 诊断技术规程

ICS65.020.99B22备案号：40457-2014江苏省地方标准DB32DB32/T2571-2013鸡传染性支气管炎RT-LAMP诊断技术规程TechnicalcodeofdetectingRT-LAMPforInfectiousBronchitis2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2571-2013前言为规范鸡传染性支气管炎RT-LAMP诊断技术规程，提高鸡传染性支气管炎病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》要求编写。本标准的附录为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：刘宇卓、李银、黄欣梅、赵冬敏、韩凯凯、张敬峰。DB32/T2571-20131鸡传染性支气管RT-LAMP诊断技术规程1范围本标准规范了鸡传染性支气管炎RT-LAMP诊断技术所用引物大小、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于鸡传染性支气管炎的实验室诊断、临床诊断、流行病学调查、分离毒株的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法3主要试剂和仪器3.1DNAMarkerDL-20003.26xLoadingbuffer3.3BstDNAPolymerase3.4MgSO43.5DEPC3.6Betaine3.7lOXThermoPolbuffer3.8异丙醇3.9无水乙醇3.10琼脂糖3.11核酸染料3.12氯仿3.13电泳仪3.14电热恒温水槽4引物按照GenBank上公布的鸡传染性支气管病毒（IBV）衣壳蛋白M基因序列保守区域，应用在线LAMPprimerdesigningsoftwarePrimerExplorer设计一套引物，序列如下：F3：5′一AAGGATTTGGCCCTCGTA一3′；FIP：5′一TGTAACACGCCCATCATAATTCCTAAGAAGGGAAATTTTGGTGAT一3′；BIP：5′一CTCATGCTTGTCTTTTTGGAAGTAGCAGTAGTAAATTCAAATCTAAGGTG一3′；B3：5′一CTGCGGGTCATCTCTAGG一3′。DB32/T2571-20132ddH20溶解成25Pmo1/ul后分装，一20℃冰箱保存备用。5临床诊断按照GB/T23197-2008鸡传染性支气管炎诊断技术方法进行临床诊断。6采样和样品的处理6.1病料的采集及处理按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，采集病料后，于0～4℃冷藏保存并立即送检，采样过程中样品不得交叉污。6.1.1对于急性呼吸道的病鸡，采集分泌物，对于刚扑杀的鸡，则采取支气管和肺组织。6.1.2对于肾型和产蛋下降型的病鸡，应采取发病鸡的肾脏及输卵管。6.2样品的处理取无菌采集支气管、肺或者是肾脏、输卵管等组织，置研钵中剪碎并研磨，反复冻融三次，将研磨好的组织以4℃12000rpm/min离心10min，取上清200µL备用。或者经过鸡胚接种后的尿囊液200µL备用。7RT-LAMP7.1RNA的提取取已处理的待检样品，以IBV阳性病毒为阳性对照，以无菌水为阴性对照，每管依次加入Trizol600µL，振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿200µL，剧烈振荡后，室温放置1min，4℃12000rpm，离心15min，取上层水相750µL，加入500µL异丙醇，混匀，-20℃放置15min，4℃10000rpm离心10min，去上清，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，4℃8000rpm离心5min，去上清，室温干燥20min，加入DEPC水10µL，使充分溶解。或使用RNA提取试剂盒进行提取。7.2反应条件FIP引物1.2μL，BIP引物1.2μL、F3引物0.15μL、B3引物0.15μL、BstDNApoLymerase2μL、lOXThermoPolbuffer2.5μL、100mmol/LMgSO41.5μL、8mmol/LBetaine5μL、10mmol/LdNTPs4μL、RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板2μL、反转录酶1.0μL、ddH2O4.8μL，总体积为25μL，瞬间离心混匀。60℃水浴60min，80℃灭活10min，4℃保存。7.3RT-LAMP试验结果观察及判定下述方法任取其一：7.3.1电泳7.3.1.1取RT-LAMP反应产物8～10μL于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30～40min，紫外灯下观察结果，并进行拍照。7.3.1.2以阳性IBV液作为阳性对照，以灭菌水作阴性对照，做RT-LAMP,所有反应产物同时电泳。在阳性对照有梯状目的条带，阴性对照无条带的情况下，检测样品出现与阳性对照相同梯状条带的判为阳性，即该样品的IBV核酸呈阳性；检测样品未出现与阳性对照相同目的条带的判为阴性，即该样品为IBV核酸阴性。如果阳性对照无相应的目的条带，或者阴性对照出现条带，结果均无效，该试验需要重做。DB32/T2571-201337.3.2显色反应7.3.2.1在每个RT-LAMP反应管内加入荧光染料SYBRGreenI0.5μL，旋涡混匀，肉眼观察颜色变化。7.3.2.2加入核酸染料后5～10min进行显色判定。肉眼观察反应管，当阳性对照管液呈现绿色，阴性对照管液呈现橘黄色时，说明染料正常，显色反应成立，可以进行其它样品的判定，否则，显色反应无效。其它样品，如反应管中液体呈绿色时，该样品即可判定为IBV核酸阳性，呈橘黄色时判定为IBV核酸阴性。8结果判定8.1临床诊断当鸡出现与第5条相符临床表现，可以初步诊断为鸡传染性支气管炎。8.2实验室RT-LAMP结果的判定同7.3。8.3诊断结果判定根据临床诊断可以初步判定为鸡传染性支气管炎的病例，结合实验室RT-LAMP检测结果，当鸡传染性支气管炎病毒检测为核酸阳性时，即可将该病例诊断为鸡传染性支气管炎。DB32/T2571-20131附录A(规范性附录)阳性样品的制备A.1毒株鸡传染性支气管炎病毒阳性毒株。A.2制备取已知保存阳性毒株，用灭菌生理盐水作1:50～100倍稀释，接种10～11日龄SPF鸡胚尿囊膜，0.1mL/枚。置37℃恒温箱继续培养，每天照蛋观察3次。弃去24h前死亡胚，无菌收获48～96h死亡胚及活胚尿囊液，12000g离心10min，吸取上清分装到1.5mL离心管中，每管200μL，-20℃保存，备用。