MIQE-Guidelines

MIQE-实时荧光定量PCR实验流程及数据处理的国际化标准及语言规则定量PCR发展及遇到问题-大量的科研工作使用定量PCR，每年产生大量的文章，但是-如何合理设计实验没有共识-如何描述实验结果没有共识（gene表达差异的柱状图，etc）-投稿时提供什么实验信息没有共识（自身说服力差、编审犯难、同行无法重复、出现大量错误结果）0100020003000400050006000700080001996199719981999200020012002200320042005200620072008200918213712836174114172325340246935230589366437236以Real-timePCR为关键词在NCBIPubmed检索结果问题数据Slope:-1.365Eff=440.26%Slope:-2.276Eff=175.02%召回的文章数据处理难点环节•相关性（扩增效率）•准确性（内参基因，扩增子二级结构）•重复性与重现性•数据分析（均一化，变异性分析）•统计分析大量无统计学意义和相互矛盾结果的发表编辑们犯难了-“定量PCR数据可信吗？” are the MIQE guidelines?qPCR的国际标准：就评价qPCR实验和发表文章时所必需的实验信息提出了最低限度的标准。指南好处•规范专业术语和概念–术语:referencegenes,qPCR,Cq(quantificationcycle)–概念:sensitivity,specificity,accuracy,repeatability,reproducibility•规范操作标准–样品获取、处理和制备–RNA或DNA质控–反转录–qPCR过程(酶,、耗材、特异性、引物序列、二级结构,、对照、校正)–数据分析(均一化,生物重复和技术重复)–评审可以更好的评估研究者所用的实验方案的有效性–确保文献的完整性和可靠性’saChecklist(检查清单)!–ExperimentalDesign（实验设计）–SampleInformation（样本信息）–NucleicAcidExtraction（核酸提取）–ReverseTranscription（反转录）–qPCRTargetInformation–（目的基因信息）–qPCROligonucleotides–（qPCR寡核苷酸）–qPCRProtocol（qPCR程序）–qPCRValidation（qPCR验证）–DataAnalysis（数据分析） Guidelines•A Check list of 80+ itemsthat describe the minimum information necessary to evaluate qPCR experiments •Broken into essential (E)and desirable (D)categories of information•Ideally the check list should be submitted with manuscripts and available online to researchers (RDML)…-Noproofof100%efficienciesfrombothtargetgeneandreferencegene-Requestedtoprovidesupplementarydata启示:实验以前应该先研究一下这个指南实验设计-实验样品的分类，处理和对照都要具备并明确定义-重复数生物性重复：不同的材料（时间、植株、批次、反应板）做的同一实验-技术重复实际上就是同一材料包括的复孔-NTC用来验证实验材料是否具有污染。-NRT是未经反转录的RNA作为阴性对照。对gDNA残留的控制。•Replicates–NeedforbothtechnicalreplicatesandBiologicalreplicates.–Numberofreplicateswilldependonlevelofdifferencesthatarebeingpresented.–Lowerexpressiongenestendtorequiremorereplicatestoestablishstatisticalvalidityofsmalldifferences.TechnicalBiologicalSampletreatment/preparation（样本信息）判定材料的质量-对样品材料的描述-肿瘤里边切下的肿瘤材料是否带有健康组织，etc。-处理过程-是否是新鲜材料-存储方式、时间-医学里边，材料的固定和处理方式（核酸提取）*Generallyacceptedratios(A260/280andA260/230)forgoodqualityRNAare1.8.SampleConc(ng/ul)A260/280*A260/230*Control-noheat1151.902.443min@90C1141.932.405min@90C1152.062.3710min@90C1152.032.3715min@90C1162.022.311hr@90C1091.992.182hr@90C1172.002.324hr@90C1181.892.23RNA 纯度和完整性RQIValue&ColorCodedClassificationExperionVirtualGelLC3’5’10’15’1h2h4hSamples6,7,8arehighlydegraded.•Experion™systemGoodQualityBadQuality反转录不管targetgene的丰度如何、起始的RNA输入量如何，反转录的效率都是一致的确保cDNA的差异能够真实反映RNAi.e.基因表达的差异。不影响表达差异的判定。:cDNAserialdilutionvs.totalRNAserialdilutionLogStartingQuantity(femtogramsofinputRNA)Note:1/10thofcDNAreactionusedforPCR123456789yeduT510152025303540cDNAStandardTotalRNAStandardcDNAtotalSlope-3.394-3.382Corr.Coef.0.9990.999Intercept38.9138.09PCRefficiency97.1%97.6%反转录效率一致性可以通过预实验来判定•实验: 梯度稀释RNA及cDNA://序列同源性分析(BLAST)（引物和探针）二级结构的影响及引物位置1110ForwardPrimerReversePrimerAPrimerBReversePrimerBPrimerB:=95.8%PrimerA:=66.3%PrimerA•Badlocationforprimers•Goodlocationforprimers55°C60°C•DesignsPrimers-singleplexassays•DesignsInternalOligos•Providesmultipleoutputs•FreeWebsoftwareprovidedbySteveRozenandWhiteheadInstituteforBiomedicalResearch.在线连接数据库-mFold,etc.-Multiplexassays（引物/探针资源共享）优化与验证欲速则不达！！！•检测特异性：熔解曲线、琼脂糖凝胶电泳、酶切、测序•借助温度梯度优化实验条件并验证实验体系，一次反应找到最合适的退火温度——高特异性、高产率发现并消除引物二聚体的潜在威胁发现并消除扩增子二级结构的潜在威胁降低引物浓