动物实验技术-动物实验的基本操作

第七章动物实验的基本技术一、动物实验的常规操作技术二、实验动物选择原则三、做好动物实验的条件第一节动物实验的常规操作技术编号、抓取、固定、给药、采血、麻醉、处死等Themarksontheanimal’srighteardenoteunitsorones:1,2,3,4,5,6,7,8,9,0.Themarksonthelefteardenotetens:10,20,30,40,50,60,70,80,90.Thesampleanimal一、动物的编号（二）染料法：此法适用于大鼠和小鼠。颜料：3%—5%苦味酸溶液（黄色），0.5%中性品红（红色），标记时用毛笔沾取上述溶液，涂斑点于动物身体的不同部位，以示不同号码。编号原则：先左后右，先上后下。（三）挂牌法：将所用号码写在金属牌上，再将金属牌固定于实验动物的耳上。大动物如猫，狗可把金属牌挂在颈部皮带圈上。（四）耳号：此法适用于家兔和豚鼠。烙印前剪毛，消毒。然后用号码烙印钳或刺数钳在动物的耳朵内面烙印号码，再用棉签蘸取溶于酒精的黑墨在号码上兴抹。兔耳号钳二、抓取固定：•（一）小鼠的抓取固定：要求既要大胆，又要仔细，不可粗暴首先要限制动物的活动（二）大鼠的抓取固定：方法基本同小鼠，抓取时为避免被鼠咬伤，可戴上帆布手套。右手抓住大鼠尾根，置于鼠笼上，左手抓取。豚鼠的保定豚鼠的保定（三）家兔的抓取固定：抓取：一般用右手抓住家兔颈部的皮肤提起，然后用左手托其臀部。不可抓双耳提腹。固定：可放于兔盒内固定或置于手术台上固定。handling三、被毛去除方法：（一）剪毛法：用手术剪紧贴动物皮肤依次将所需剪毛部位的被毛剪去。不可用手提起被毛，以免剪破皮肤。（二）拔毛法：兔耳缘静脉注射，取血时，可在其耳内面局部拔毛。（三）脱毛法：用于手术前动物皮肤局部脱毛。方法：首先剪短动物被毛。然后涂脱毛剂，2-3分钟后用温水清洗干净，最后涂上一层油脂。脱毛剂的配制：下列3种方法适用于小鼠，小鼠和家兔。1、硫化纳3克+肥皂粉1克+淀粉7克+水适量，调成糊状。2、硫化纳8克+淀粉7克+糖4克+甘油5克+硼砂1克+水75毫升3、硫化纳8克+水100毫升四、给药途径和方法：（一）皮下注射：方法：左手拇指和食指提起皮肤，将连有5号针头的注射器刺入皮下0.5-1ml/只。注射部位：小鼠注射部位在腹部两侧，大鼠注射部位在下腹部两侧，家兔注射部位在背部或耳根部。（二）肌肉注射：方法：由皮肤表面垂直刺入肌肉，回抽无血，即可注射。注射部位：小鼠,大鼠的注射部位在后肢大腿外侧0.1ml，家兔的注射部位在臀部。方法：左手抓住小鼠或大鼠，使其腹部向上，头处于低位，使内脏移向上腹，右手持注射器从下腹两侧向头方刺入腹腔。家兔在进行腹腔注射时，首先由助手固定兔子，另一人持注射器从家兔下腹1/3处，腹中线稍偏向两侧，垂直刺入腹腔0.1-0.2ML/10g。注射部位：小鼠在腹部两侧，大鼠在下腹两则，家兔在腹部下1/3处，中线两侧1厘米左右。（三）腹腔注射大鼠腹腔注射（四）静脉注射：1、小鼠和大鼠的静脉注射：部位：尾静脉下1/4处皮肤薄，常在此处进针。鼠尾静脉有三根，尾部背侧一根，尾部两侧各一根。尾部两侧的静脉比较容易固定，多在此处取血。尾部背侧的静脉位置容易移动，不采用。collectioninadultmice(average20g):SafeinjectionvolumeIVTotalbloodvolumeSafebleedvolumeBleed-outvolume0.21.0---2.40.2---0.40.6—1.4方法：先用酒精擦试，或用45-50℃温水浸润鼠尾，使之表皮软化，血管扩张。然后用左手拇指和食指捏住鼠尾两则，使尾静脉充血，同时用中指从下托起鼠尾，用无名指和小指夹住鼠尾的末梢，右手持注射器从尾下1/4处平行角度刺入尾静脉。2、家兔的静脉注射：耳缘静脉VeinArteryVein（五）胃内注入给药：1、小鼠和大鼠：方法：先用左手固定小鼠或大鼠，使其成垂直立位。右手将灌胃针从鼠的右口角插入口中，再沿咽后壁慢慢插入食道，灌胃针插入时应无阻力。如感到有阻力或动物挣扎，应停止进针，拔出重新插入。大小鼠胃内注入给药2134562、家兔：方法：首先固定家兔，再将扩口器放入口中，置于上，下门齿之后，将14号导尿管从扩口器中央的小孔通过，沿咽后壁插入食道。插入后，应检查导尿管是否确实插入食道，可将导尿管外端的口入一只盛满水的烧杯中，如无气泡产生，表明导尿管被正确插入胃中，再将导管与注射器相连，注入药液。Oralfeed（一）小鼠的采血：1、尾静脉采血：固定动物，用手揉擦鼠尾，或把鼠尾放入45-50℃的温水中，使尾部血管充血，剪去尾尖0.3-0.5厘米，让血液入盛器，或用血红蛋白吸管吸取。最后压迫止血。五采血collectionofbloodfromtailveinRAT用乙醚吸入麻醉小鼠或大鼠，使其侧卧，一只手拉紧眼眶周围皮肤，另一只手持玻璃毛细管（吸管头呈斜角）由眼内角刺入，不断向下捻动，血从自毛细管口流出，盛入试管中。2、眼眶静脉丛采血3、心脏采血：用乙醚吸入麻醉大鼠，然后使鼠仰卧固定，手持注射器，在鼠胸部心跳最强处垂直刺入采血。小鼠隐静脉（saphenousvein)采血BloodCollectionFromCardiacPunctureinMouseSmallbloodsamplescanbecollectedfromalateralearvein.（二）家兔的采血：1、耳缘静脉采血2、心脏取血3、颈动脉Slide30.家兔采血步骤1243心脏取血1236546六麻醉（一）麻醉药分类：1、挥发性麻醉剂：2、非挥发性麻醉剂：（二）麻醉方法：1、全身麻醉（1）吸入法：（2）腹腔和静脉给药麻醉法：小/大鼠常采用腹腔注射非挥发性麻醉药，家兔常采用静脉注射非挥发性麻醉药。2、局部麻醉:采用盐酸普鲁卡因皮下注射麻醉。七、处死（安乐死）安死术(eutanasia):指公众认可的、以人道主义的方法处死实验动物的过程，使动物达到没有惊恐或焦虑而安静地、无痛苦地死亡。安乐死方法的的标准是:1、对动物：保证实验动物中枢神经系统立即达到失去痛觉的早期抑制作用,使动物不产生疼痛、惊恐、挣扎、叫喊以及不适的其他表现;2、对操作人员：安全、容易操作且道德能为操作人员所接受3、对环境：无污染或无有影响;4、其后研究工作：不引起会干涉其后研究工作的组织病理学变化。美国《实验动物管理与使用指南》规定:1、动物安乐死应由经过训练的人员根据有关机构的政策和适用法律来实施。2、方法的选择取决于动物的种类与研究的课题需要。经批准的方法应遵循美国兽医协会安乐死小组的规定。安乐死的方法：（一）小鼠和大鼠1、断颈髓法：右手抓住鼠尾，让其向前爬，左手拇指和食指用力向前下方按住鼠头，将颈椎拉断。2、化学致死法：（1）吸入过量乙醚，氯仿致死。（2）皮下注射士的宁处死：小鼠为每千克体重用药0.76-2.0毫克，大鼠为每千克体重用药3.0-3.5毫克。（3）静脉注射氯化钾：大鼠每只注射25%的氯化钾溶液0.6毫升。(二)家兔：1、空气栓塞法：兔耳缘静脉内注射空气，每只用量为20-40毫升。2、化学致死法：皮下注射士的宁，家兔用量为每千克体重用药0.5-5毫克。3、过量酒精：（三）猴：1、戊巴比妥钠静脉注射100mg/kg动物尸体处理(一)实验动物尸体剖检实验动物处死后0.5h内必须进行尸体解剖,可先取出胸腔脏器、后取出腹腔脏器、头部器官的解剖可先、可后。(二)实验动物尸体的处置原则：保证人畜，安全、保护环境生态，即无害化处理禁止：尸体或脏器组织倒入垃圾箱中随意处理。Questions??选择什么样的实验动物是医学科学研究工作中一个重要环节，因为在不适当的动物进行实验，常可导致实验结果的不可靠，甚至使整个实验徒劳无功，直接关系到科学研究的成败和质量。第二节实验动物的选择原则一、查阅文献，加强交流：通过充分地查阅文献，可了解本领域、本项目以往使用的实验动物情况及其研究结果，有利于充分利用前人的研究成果、研究思想，避免重复研究。传统应用的实验动物是科技工作者长期以来实践经验的积累，各个专业、各个课题都有自己常用的动物品种和品系。二、预试验：通过自己直接观察和了解某种动物品种品系是否适合本课题研究。动物预试验的作用在于：⑴初步观察动物是否适宜于本项目的研究；⑵熟悉动物的生物学特性及饲养管理；⑶检查与动物实验配套的实验条件、方法是否初步到位。三、相似的的原则：选用与人的机能、代谢、结构及疾病特点相似的实验动物。医学科学研究的根本目的是要解决人类疾病的预防和治疗问题，因此，在实际可能的条件下，尽量选择那些机能、代谢、结构和人类相似的实验动物作实验。一般来说，实验动物愈高等，进化愈高，其机能、代谢、结构愈复杂，反应就愈接近人类，猴、狒狒、猩猩、长臂猿等灵长类动物是最近似于人类的理想动物。如：猕猴的生殖生理和人非常接近，月经周期和人一样约28天左右，是研究人类避孕药的理想动物；猕猴也是制造和鉴定脊髓灰白质炎疫苗的唯一实验动物。但需特殊动物房和饲养，因此，在选择时不能盲目追求。在无法得到猴的条件下可选用大小鼠、犬等其它动物。犬具有发达的血液循环和神经系统以及基本上和人相似的消化过程，在毒理方面的反应和人比较接近，适于作实验外科学，营养学、药理学、毒理学、生理学和行为等研究。猫也具有发达的神经系统和循环系统，血管坚韧，血压稳定，适宜作神经和循环方面的研究。两栖类蛙的大脑很不发达，和人类相差甚远，就不能选它来作高级神经活动的实验，但是如果要作一个简单的神经反射弧的实验，选用蛙就很合适，因为最简单的反射中枢位于脊髓，蛙的脊髓已发展到合乎实验要求的程度，而且越简单的分析时越明确，高等动物的反射弧复杂，反而难于分析。四、选用与课题相匹配的标准化实验动物：医学科研实验中的一个关键问题，就是怎样使动物实验的结果正确可靠，有规律，重复性高，从而精确判定实验结果，得出正确的结论。必须到具有动物生产条件及具有动物质量合格证的单位购买动物，并应向供应动物者索取其标有动物级别、合格证编号等的动物质量合格证明单据。避免随意、随便购买动物。遗传类别选择：根据课题的需要选用近交系动物、突变模型动物、封闭群动物或杂交F1动物。1）、不同品种的动物对同一种刺激反应差异很大如猪瘟细胞毒的效力检查中，白兔比灰兔敏感，而长毛兔反应最敏感，发热反应最典型。2）、不同品系的动物，对同一种刺激反应差异很大DBAMice对音响敏感，而C57没有。如C57BL小鼠各种肿瘤发生率低，但A系80%的繁殖母鼠均患乳腺癌。微生物学级别选择：应根据其各级动物的特点、应用范围及课题的水平的高低，选用相匹配的微生物学级别的实验动物。急性毒性试验、教学实习对动物要求不高；致癌性，致畸性，慢性毒性试验，生化试验，免疫学试验等，对精度要求较高，必须排除体内外微生物、寄生虫及遗传上个体差异所带来的不利影响。SPF动物则是国际标准的实验动物，对于一些具有国际交流意义的重大课题，最好选用SPF动物。无菌及悉生动物为非常规动物仅在特殊课题需要时才选用。为了使自己的实验结果精确可靠，易重复性和可比性，最好选标准化的实验动物在标准条件下进行实验五、选用解剖、生理特点符合实验目的要求的动物：很多实验动物具有某些解剖生理特点，为实验所要观察的器官或组织等提供了很多便利条件动物的生理状态:如怀孕哺乳等对实验结果影响很大，因此，实验不宜采用处于特殊生理状态的动物进行，如在实验过程中发现动物怀孕，则体重及某些生理生化指标均可受到严重影响。动物的健康状况对实验结果有直接的影响六、选择不同种系实验动物（存在的某些特殊反应）实验研究中常要选用对实验因素最敏感的动物作为实验对象，因此必须了解不同实验动物存在的某些特殊反应性。家兔对体温变化十分灵敏，适于发热、解热和检查致热源等实验研究。小鼠和大鼠体温调节不稳定，就不宜选用。鸽子、家犬、猴和猫呕吐反应敏感，适作呕吐实验，家兔、豚鼠等草食动物呕吐反应不敏感，小鼠和大鼠无呕吐反应，就不宜适用。七、选用人畜共患疾病的实验动物和传统应用的实验动物有些疾