单糖的离子色谱法分离及检测

2012年第14卷第10期（总第108期）1839糖是生物体内除核酸和蛋白质之外另一类重要的生命物质。多糖、寡糖以及它们与蛋白质、酯类等结合形成的糖复合物涉及到细胞,特别是多细胞的生命的全部时间和空间过程[1],如糖类作为信息分子参与细胞的各种识别过程、传递生物信息、参与机体的免疫调节与细胞分化、受精、胚胎发育、血液系统、感染、衰老等。目前,大致有两种方法来定量的分析糖,它们是酶法和色谱法。由于样品中的杂质较多且酶的纯化较困难,因此即使酶法有较高的特异性和灵敏性,这种方法往往不被采用。所以普遍采用色谱分析法来检测糖,主要有毛细管电泳、气液相色谱、和离子色谱等方法。近年来兴起的离子色谱-脉冲安培检测法更为突出,利用糖分子在pH值的淋洗液中带负电的形式,能够结合在阴离子交换柱上并被分离。2010年10月~2012年6月,本实验成功运用阴离子色谱-脉冲安培检测系统进行实验,从两种药品中分离检测了8种常见单糖,取得满意结果,省去了衍生和复杂的样品前处理。1离子色谱法简介1.1离子色谱法1975年,H.Small等人创立了离子色谱法(ionchromatography),它是在经典的离子交换色谱法(ionexchangechromatography)的基础上发展起来的[2]。以离子交换树脂做固定相,与流动相中的离子进行交换,利用待测离子对交换剂具有不同亲和力这一原理(作用力)实现分离。随着科学技术的发展,离子色谱法会被广泛推广使用。此种方法具有速度快,灵敏度高,还能同时进行多种离子的分离,并且也能将中性物质转变成离子型物质,所以在生物医药、食品化学、电子、环境化学和化工等领域得到了广泛应用[3]。随着科技的发展,离子色谱法将逐渐被毛细管电泳技术所取代,成为主要的分析方法。但多数分析工作者坚信在今后相当长的时间内,离子色谱法仍将是离子性物质(持别是无机阴离子)的最佳分离分析方法。其硬件和应用技术还会有较大的发展。可以说,离子色谱法已经是一种硬件相当成熟的技术,其研究的重点是应用领域和对象的开发。毛细管电泳技术则以基础性的研究为主。所以,采用毛细管电泳技术分析离子性物质的应用会越来越成熟和广泛[4]。毛细管电泳技术和离子色谱法将长期共存,互为补充,给分析工作者的选择余地更大。1.2离子色谱仪和一般的高效液相色谱仪器一样,现在的离子色谱仪一般也是先做成一个个单元组件,然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统(记录仪、积分仪或化学工作站)。此外,还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度装置、自动进样系统、流动相抑制系统、柱后反应系统和全自动控制系统等[5]。作为离子色谱仪最主要的结构组成,一个完整的流动相输送系统包括脱气装置、流动相容器、输液泵和梯度洗脱装置四部分。这些部件需要使用玻璃或者不锈钢等材料来制造,因为要具备耐酸碱和有机溶剂的功能。色谱柱中的填充颗粒是在高压环境下完成填充的,所以流动相在流经时会有阻力,这就要求仪器提供较高的进口压来维持适当的流速[6]。分析柱在使用时,随着时间的增长,柱压会逐渐增大。其流程一般为流动相在高压泵的作用下以稳定的流速进入系统,进样器将样品导入,流动相携带样品进入色谱柱,在这里样品中的各组分就会被分离开来,并依次进入检测器药物分析单糖的离子色谱法分离及检测曹莉(江苏省镇江市第一人民医院门诊西药房,镇江212000)【摘要】目的:建立分离测定甘露醇、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖等8种单糖成分的高效阴离子色谱法。方法:利用离子色谱分离柱,在10.0mmol/LNaOH溶液为流动相的条件下,通过脉冲安培检测器,分离检测八种单糖。结果:各种单糖在0.1~5.0μg/mL浓度范围内线性良好,方法检出限2~26μg/L。用本法测定了两种药品多糖水解产物中的单糖组分,均取得较为满意的结果。结论:该方法具有较高的灵敏度和精密度,在药品中单糖的分离及检测中应用良好。【关键词】单糖;离子色谱法;分离;检测【中图分类号】R917　【文献标识码】A　【文章编号】1009-0959(2012)10-1839-03SeparationandDetectionofMonosaccharidebyIonChromatographyCaoLi(ZhenjiangFirstPeople’sHospitalofJiangsuProvince,Zhenjiang212000,China)【ABSTRACT】Objective:Todevelopamethodforanalysisofeightkindsofmonosaccharaidesincludedmannito,fucose,rhamnose,arabinose,galactose,glucose,xylose,fruotosebyusinghighperformanceanionexchangechromatography.Methods:UsetheionchromatographytoSeparateanddetectmonosaccharidewiththepulseaerometricdetectorundertheconditionof10.0mmol/LNaOHastheflowing.Results:Thelinearrangewas0.1~5.0μg/mLandthedetectionlimitswere2~26μg/L.Thesatisfactoryresultswereobtainedforanalysisofpolysaccharidehydrolyzesoftwodrugswiththeproposedmethod.Conclusion:Thismethodwasavailablefordeterminationofmonosaccharideinpolysaccharidehydrolyzateofdrug.【KEYWORDS】Monosaccharide;Ionchromatography;Separation;DetectionChineseJournalofMedicinalGuide2012Volume14No.10(SerialNo.108)1840进行检验。抑制性的离子色谱就是在检测器前添加一个抑制系统,将再生液输送到抑制器,此时流动相的背景电导就会被降低,流出物送入电导池,检测的信号进行处理、记录保存等。2药品中单糖的离子色谱法分离及检测2.1分离及检测原理2.1.1单糖的离子色谱法分离原理破水化合物是弱酸,在pH＞12时部分以阴离子形式存在,所以可以用含有疏水季铵盐反离子的强碱性流动相以及聚合物固定相或HypercarbPGC柱分离了碳水化合物。离子对试剂十二烷基乙基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵和壬基三甲基溴化铵通过与Ag2O混合以及用二氯甲烷萃取被转变成氢氧化物形式。糖、糖酸、氨基糖和低聚糖可用这些离子对试剂、PS/DVB柱或HypercarbPGC柱分离。调节分离效率和选挥性的重要参数是反离子的性质与浓度、流动相的pH值(氢氧化物浓度)和柱温。低聚糖在这些色谱系统中的保留较强。在流动相中加入有机改进剂会对脉冲安培检测造成干扰。由于其它阴离子对离子对形成产生竞争效应,因此在流动相中加入阴离子可减小溶质保留[7]。因为糖分子具有复杂的空间结构,所以一些同分异构体就不容易分离,这可以通过梯度淋洗,通过改变流动相的pH值,因为各种糖分子的PK值是不同的,通过这种方法可以做到有效的分离。2.1.2单糖的离子色谱法检测原理这种方法使用的是脉冲安培检测器,电极使用的是金电极。因为糖容易在有电位的金电极表面发生化学反应。这种检测方法不需要复杂的样品前处理,并且非常灵敏。因为糖的氧化产物对电极存在不可逆的破坏,所以不能使用直流安培检测器[8]。2.2实验材料与方法2.2.1主要仪器与试剂CIC-300离子色谱仪;类型:高压双柱塞串联往复平流泵(可选配PEEK泵)。进口泵最大压力:42MPa;PEEK泵最大压力:35MPa;流量范围:0.001~9.999mL/min;压力显示精度:≤0.1MPa;流量精度:RSD0.1%;流量重复性:RSD≤0.1%。NaOH、超纯水、单糖分子标准(鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、甘露醇、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖和木糖,于青岛海博生物公司购买,纯度99.9%)。配置单糖校准溶液:在25ml的容量瓶中,依次称取25mg的鼠李糖、葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、果糖、半乳糖、木糖和岩藻糖,超纯水定容,配成1000mg/L的储备液。2.2.2实验步骤2.2.2.1色谱条件(1)分离条件:分离流动相为10.0mmol/LNaOH;进样量设定为20ul;分离柱温度设定为30℃。(2)洗脱条件:流动相洗脱程序设定为:10.0mmol/LNaOH洗脱16分钟——250mmol/LNaOH洗脱30分钟——10.0mmol/LNaOH洗脱14分钟。(3)检测条件:脉冲安培检测波形设定为:+0.05V电位持续0.40分钟——+0.75V电位持续0.20分钟——-0.15V电位持续0.40分钟;0.2min时开始积分,0.40min结束积分。2.2.2.2样品前处理先称取样品后用乙醇沉淀,分离出单糖以后测多糖含量,使用蒽酮比色法。多糖样品中加硫酸加至浓度为1mol/L为止,沸水浴水解1小时。之后用NaOH中和至中性,定容到100ml,离心取上清并加水稀释。3结果和讨论3.1确定梯度淋洗条件随着淋洗液PH的增大,糖的姐力度差异会变小,因此保留值也会相应减小,导致分离效果变差。考察梯度淋洗条件对对糖分子分离的影响发现,随着NaOH浓度的增加,阿拉伯糖和鼠李糖的分离程度变大,导致半乳糖和葡萄糖的分离度变小。综合考虑,选10.0mmol/L的NaOH溶液做流动相。3.2优化分离柱的柱温考察不同温度的单糖混合液在10.0mmol/L的NaOH流动相的条件下的分离情况[9]。结果表明,在温度40℃时,葡萄糖和半乳糖分离程度变小,温度30℃时,各单糖表现为分离灵敏度有一定程度的损失。综合分离情况,确定分离柱温为30℃,结果表明在30℃柱温下,8种单糖峰形较好,能达到基线分离。3.3确定检出限和线性范围在优化的分离条件下,使用不同浓度的标准溶液绘制标准曲线,以基线三倍噪声所对的标准溶液的浓度作为检出限[10,11](见表1)。表1线性范围和检出限成分回归方程检出限(μg/L)回归率甘露醇Y=5.59x+0.29130.998岩藻糖Y=4.51x+0.25130.998鼠李糖Y=2.67x+0.12220.998阿拉伯糖Y=5.14x+0.37110.997半乳糖Y=6.67x+0.2020.998葡萄糖Y=6.74x+0.2020.999木糖Y=6.55x+0.4120.999果糖Y=3.66x+0.29270.9983.4精密度实验分别配置浓度为1.0mg/L的单糖混合液,分别进行检测,峰面积和保留时间的标准偏差在1.02%~3.16%和1.34%~6.42%的范围内。3.5药品样品加标回收实验样品平分为6份,一半用于本底值的测定,剩余的加入标准溶液进行测定,计算回收率。结果得到平均加标回收率在80.9%~121.9%3.6药品样品中单糖含量测定对药品样品进行分析(表2)。结果表明,保健样品1中的多糖占1.7%,其中的单糖组成为木糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖含量分别为12.9%、70.1%、12.2%、4.6%。保健样品2中的多糖占2.1%,其中单糖的组成是果糖、木糖、葡萄糖、半乳糖,他们的含量分别是36.7%、5.6%、50.4%、6.7%。综上,用离子色谱法分离、测定药品多糖的水解产物表2样品测定结果样品甘露醇岩藻糖鼠李糖阿拉伯糖半乳糖葡萄糖木糖果糖药品1———4.6%12.2%70.1%12.9%—药品2————6.7%50.4%5.6%36.7%(下转1838页)ChineseJournalofMedicinalGuide2012Volume14No.10(Se