蛋白表达纯化步骤

一证明目的蛋白有表达1挑取一单菌落接种于含（AMP，终浓度为100g/ml）的3ml液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。2将过夜培养菌液以1:100转接于含抗生素的100ml液体LB中，37℃，250rpm3.5h（大量培养至OD600=0.6左右）3取出1ml菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养物加入IPTG至终浓度为1mmol/L。继续震荡培养4h。4以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液做对比，SDS-PAGE检测。结果如图一1未诱导2未诱导3诱导后4诱导后二表达的情况，是可溶还是沉淀1将上述的37℃诱导的菌液离心（4℃，12000,5min），弃上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl溶液洗菌。2重悬于0.9%NaCl溶液的菌体离心，（4℃，12000,5min），弃上清（0.9%NaCl溶液），得菌体，称菌体重量，悬于8mlPBS（PH7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/ml的菌液终浓度。3超声波破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声波设置如下：功率：400W工作：15min间隔：45s全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠，可能加DNA酶会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没有加DNA酶），不然分不开）4将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000,5min），分别收集上清和沉淀，各取1ml，加入1ml2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。结果如图2三探索可溶表达条件有上述结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性表达，但是量很少，大部分以包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明蛋白的表达量很高，上清可溶性蛋白的可操作性等因素的干扰优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶性蛋白的表达条件，最终加大上清可溶性蛋白的含量，以便实现下一步实验的进行。影响包涵体形成的因素有很多，如诱导温度，诱导时间，IPTG浓度，摇床转速等等，所以设置低IPTG浓度0.1mmol/L，在不同温度，诱导时间上对照的表达对照：1）37℃，250rpm，5h2）30℃，180rpm，10h3）23℃，90rpm，30h过程：挑取一单一菌落接种于氨苄（Apm，终浓度为100g/ml）的3mlLB液体培养基中37℃，250rpm培养过夜，将过夜培养的菌液以1:100转接于含上述抗生素的50ml+50ml+60ml液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养OD600=0.6左右）。从60ml培养液中取10ml做未诱导对照，标记3个50mlLB培养菌液：1）37℃，250rpm，5h2）30℃，180rpm，10h3）23℃，90rpm，30h都分5次取样：37℃每1小时取一次（取10ml）30℃每2小时取一次（取10ml）37℃每5小时取一次（取10ml）诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。SDS-PAGE检测：137℃M12345五样的上清和沉淀230℃M12345五样的上清和沉淀323℃M12345五样的上清和沉淀4不同温度下最优可溶性表达比较结果如下：由图可知，23℃条件下，明显提高上清目的蛋白的含量，并且，存在可溶性表达平衡，即20h以后，蛋白表达将以包涵体的形式存在，即无论如何改变条件，可溶性表达已到极限，所以无需探索更低温度等条件。四大量制备，表达与纯化配制1LLB液体培养基，分装成100ml×10瓶，分别有利于大肠杆菌生长和后续操作。诱导培养：挑取：挑取一单一菌落接种于氨苄（Apm，终浓度为100g/ml）的3ml×5管LB液体培养基中37℃，250rpm过夜，将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100ml×10瓶液体LB中，37℃，250rpm，3.5h（大量培养至OD600=0.6左右），取出1ml菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养物加入诱导物IPTG至终浓度为0.1mmol/L，23℃，90rpm，继续震荡培养20h。破菌收集上清：分别离心（4℃，12000,5min），加8ml×10管PBS（PH7,0）缓冲液重悬后，冰浴条件下超声波破碎（400W，15s，45s，30min）收集上清（8ml左右×10管）稀释过滤上清：8ml左右×10管菌液用PBS（PH7.0）缓冲液稀释为2倍，并过0.45nm滤膜，取1ml留样过镍柱纯化（8ml左右×10管×2倍=160，分2次过柱，每次80ml）A用缓冲液I（PBSPH7.0缓冲液）再洗5个床体积，流速为2ml/minB将稀释过滤后的上清上样，流速为1ml/minC用缓冲液I（PBSPH7.0缓冲液）再洗5个床体积，流速为2ml/min，使目标蛋白充分挂柱。D用50ml的咪唑的缓冲液III，洗去杂蛋白，流速为2ml/min，并收集洗杂峰E用50ml的咪唑的缓冲液III，流速为1ml/min，并收集洗脱峰，收集洗脱液F将收集洗脱液用15ml超滤离心管首次超滤浓缩，收集各次浓缩液，分装成每管1.5ml，取1ml4℃备用，其余-80保存G各取1ml过柱前，挂柱穿透，洗杂液，洗脱液加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。