江苏省2020高考生物大一轮复习 第13单元 第1讲 基因工程的基本工具与操作程序课件

第十三单元现代生物科技专题构网络·理清脉络①_________________________②_______________③__________④_______________⑤__________⑥__________⑦_______________⑧__________⑨__________限制性核酸内切酶(限制酶)DNA连接酶目的基因基因表达载体检测与表达循环再生植物组织培养单克隆抗体胚胎移植第1讲基因工程的基本工具与操作程序析考情·明确考向考查内容等级要求五年考情素养体现复习指导基因工程的诞生A2016年T33；2014年T23基因工程的原理及技术B2018年T32；2017年T33；2016年T33；2015年T32、T33；2014年T23生命观念：熟练说出DNA重组技术的基本工具及其作用、特点；科学思维：简述基因工程基本操作程序，以及各步骤的一般方法、原理，构建出操作流程图；科学探究：模拟重组DNA分子的操作过程，正确选择限制酶和构建基因表达载体，能够分析相关实验的设计、操作及结果理解基因工程的原理，如PCR技术的原理和过程、基因表达载体的结构组成和功能等，同时加强关键术语如限制酶、DNA连接酶、质粒显微注射、检测等的记忆；列表比较限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶等酶的作用及特点；归纳PCR技术的DNA扩增过程和基因工程的操作过程及注意事项过基础·自我排查栏目导航抓核心·解疑释惑验效果·随堂演练过基础·自我排查一、基因工程的概念项目内容主要技术体外DNA重组技术和转基因技术操作环境_____操作水平__________理论依据基因重组供体提供__________受体表达目的基因基本过程剪切→拼接→导入→表达本质性状在_____体内的表达优点克服_______________的障碍，定向改造生物的__________体外分子水平目的基因受体远缘杂交不亲和遗传性状二、基因工程的基本工具三、基因工程的操作程序1.基本操作程序2.基因表达载体的组成及各部分的作用(连线)请思考：天然的DNA分子可以直接用做基因工程的载体吗？为什么？[答案]基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒，即独立于细菌拟核处DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。作为基因工程使用的载体必须满足以下条件：①载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活；②载体DNA必须具备自我复制的能力或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；③载体DNA必须带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选；④载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害；或不能进入除受体细胞外的其他生物细胞中去；⑤载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作。自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。抓核心·解疑释惑考点一基因工程的基本工具核心提炼1.基因工程的三种工具限制酶DNA连接酶载体作用切割目的基因和载体拼接DNA片段，形成重组DNA携带目的基因进入受体细胞作用部位一条脱氧核苷酸链上的相邻两个核苷酸之间的磷酸二酯键——作用特点(条件)①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列；②在特定位点上切割①E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端；②T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；②有一个至多个限制酶切割位点；③具有特殊的标记基因常用类型EcoRⅠ限制酶、SmaⅠ限制酶E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等2.与DNA相关的酶(1)与DNA相关五种酶的比较限制酶DNA连接酶解旋酶DNA聚合酶DNA(水解)酶原料含有目的基因的DNA两个(具有相同黏性末端或平末端)DNA片段双螺旋DNA模板链和游离的4种脱氧核苷酸DNA分子产物具有黏性末端或平末端的目的基因和其他DNA片段一个DNA片段部分解旋的DNA新的DNA分子游离的脱氧核苷酸化学键破坏磷酸二酯键形成磷酸二酯键破坏氢键形成磷酸二酯键破坏磷酸二酯键(2)限制酶和DNA连接酶的关系图示(3)DNA连接酶和DNA聚合酶的主要区别连接的对象不同。DNA连接酶连接两个DNA片段，催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；而DNA聚合酶是把游离的脱氧核苷酸连接到引物或者已有的DNA单链上，催化形成磷酸二酯键。方法规律对限制酶切割位点的三点要求(1)位置要求：限制酶切割位点所处的位置必须在标记基因外，只有这样才能保证标记基因的完整性。(2)数量要求：选择限制酶切割目的基因时，被选择的限制酶在目的基因的两侧都要有识别序列，这样才能切割出完整的目的基因。(3)对象要求①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。②为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接，即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。3.载体必须具备的条件分析条件适应性稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择4.最常见的标记基因——抗生素的抗性基因目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：命题研究_限制酶的选择和利用(2018·江苏模拟)已知限制性核酸内切酶XmaⅠ和SmaⅠ的识别序列分别为C↓CCGGG和CCC↓GGG。下列有关这两种酶及应用的叙述，错误的是()A.这两种酶作用的底物都是双链DNAB.DNA中出现这两种酶识别序列的概率不同C.XmaⅠ切割DNA形成的黏性末端是—GGCCD.使用这两种酶时需注意控制反应温度、时间等B[解析]限制酶作用的底物是双链DNA分子，A正确；这两种限制酶作用的核苷酸序列相同，所以识别序列的概率相同，B错误；根据碱基互补配对原则，CCCGGG的互补链是GGGCCC，并根据XmaⅠ的切割位点可知，切割后的黏性末端是—GTAG，C正确；温度能影响酶的活性，所以使用酶时需要注意控制反应温度和时间等，D正确。易错提醒(1)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)不同的限制酶识别序列不同时，可以具有相同的黏性末端。(4)不同的限制酶识别序列相同时，由于具有不同的切割位点，因此(黏性)末端不同。(2018·徐州期末)限制酶BamHⅠ和BglⅡ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为G↓GATCC和A↓GATCT。研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并连接得到重组质粒。下列相关叙述正确的是()A.限制酶作用DNA过程中将碱基对之间的氢键切断B.目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是—CTAGGC.经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别D.分别用两种限制酶切割，保证了目的基因定向插入质粒C[解析]限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，A错误；目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是—CTAG，B错误；经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别，C正确；分别用两种限制酶切割，由于形成的黏性末端相同，因此并不能保证目的基因定向插入质粒，D错误。_基因载体和标记基因(2018·徐州模拟)质粒是基因工程中最早应用的载体，下列相关叙述正确的是()A.质粒只有一个限制酶切割位点B.质粒上有特殊的标记基因C.质粒不能在受体细胞中自我复制D.质粒含有2个游离的磷酸基团B[解析]质粒有一个或多个限制酶切割位点，A错误；质粒上有特殊的标记基因，便于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞，B正确；普通质粒在宿主细胞内也能进行自我复制，C错误；质粒是环状DNA分子，没有游离的磷酸基团，D错误。下列有关基因工程的载体中标记基因的说法，不正确的是()A.可检测重组DNA分子是否导入了受体细胞B.可指示哪些细胞是转化细胞C.可指示载体DNA分子中是否插入了外源DNA片段D.可检测目的基因在受体细胞中是否成功表达D[解析]检测目的基因是否转录采用分子杂交技术，检测目的基因是否翻译采用抗原—抗体杂交法，D错误。考点二基因工程的操作程序重点解读核心提炼1.理解基因表达载体的构建(1)基因表达载体的组成(2)一般构建过程2.目的基因导入受体细胞的比较生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞等转化过程将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体(DNA分子与感受态细胞混合)→感受态细胞吸收DNA分子3.图解目的基因的检测与鉴定易错提醒(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。(2)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。(3)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。②起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。(3)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)，从而将含目的基因的细胞筛选出来。(4)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象：第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测时的分子水平杂交。(5)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的T－DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。(6)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。(7)受体细胞的选择：受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是其营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是其无细胞核，不能合成蛋白质。4.理解PCR技术(1)PCR技术原理(2)RCR技术中所需要的条件条件作用有一段已知目的基因的核苷酸序列便于合成引物在一定的缓冲液中进行提供相对稳定的pH环境4种脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料DNA母链作为DNA复制的模板TaqDNA聚合酶催化合成DNA子链(耐高温)引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(3)PCR反应的过程过程说明图解变性当温度上升到95℃左右时，双链DNA解聚为单链复性温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸温度上升到72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸循环重复上述过程，n次循环后，目的基因的量将被扩增2n倍(4)PCR过程中的数量关系①PCR过程模