2019-2020学年高中生物 专题2 微生物的培养与应用 2-2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

02微生物的培养与应用课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课标解读知识目标1．研究培养基对微生物的选择作用2．进行微生物数量的测定能力目标1．模仿土壤取样、梯度稀释、平板划线、菌落统计的过程和方法2．熟悉微生物的培养和观察的要领情感态度与价值观1．理解农业生产与土壤微生物的关系2．认同生物与相适应环境之间的相互关系课前导学1．实验中微生物筛选的原理是：人为提供有利于________生长的条件(包括________、______、______等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。利用稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的________菌落，来源于样品稀释液中的________活菌。通过统计平板上的__________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在____________的平板进行计数。2．尿素是一种重要的农业氮肥。实践证明，尿素并不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的细菌将尿素分解成______之后，植物才能利用其中的氮。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成________。这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起________作用。3．选择培养基：在微生物学中，将允许______种类的微生物生长，同时________或______其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。4．培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布______个平板，才能增强实验的说服力与准确性。5．实验中设置对照的主要目的是排除实验组中__________对实验结果的影响，提高实验结果的________。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养__________的培养基作为空白对照。6．对分离的菌种作进一步的鉴定，需要借助____________的方法。如在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，这样，我们就可以准确的鉴定______________________。答案1．目的菌株营养温度pH一个一个菌落数30～3002．氨脲酶催化3．特定抑制阻止4．35．非测试因素可信度牛肉膏蛋白胨6．生物化学该种细菌能够分解尿素知识点解读知识点一筛选菌株1．筛选思路科学家从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的水生耐热细菌TaqDNA聚合酶。为什么水生耐热细菌能从热泉中被筛选出来呢？这是因为热泉70～80℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的水生耐热细菌脱颖而出。实验室中微生物的筛选，也应用了同样的原理，即人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。从而分离获取目的菌。2．筛选方法筛选目的菌株就是利用选择培养基，对微生物进行选择培养，从而获得所需的微生物。(1)选择培养基：就是根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感程度不同，在培养基中加入相应特殊营养或化学物质，抑制不需要微生物的生长，有利于所需微生物的生长，以此将某种微生物或某类微生物从混杂微生物群体中分离出来的培养基，属固体培养基。(2)选择培养：微生物的选择培养就是利用选择培养基的特殊组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术。(3)进行微生物选择培养的培养基有两类：原理举例1依据某些微生物的特殊营养要求分解纤维素的细菌——纤维素作唯一碳源分解石蜡油的细菌——石蜡油作唯一碳源自生固氮微生物——缺乏氮源的培养基产生蛋白酶的微生物——蛋白质作唯一氮源2加入某种化学物质抑制或杀死其他微生物加入10%的酚——抑制细菌和霉菌生长加入青霉素——抑制细菌和放线菌生长(4)分解尿素的细菌的分离，就是利用该细菌以尿素为唯一氮源的特征，配制以尿素为唯一氮源的固体培养基，以造成有利于目的菌生长并抑制其他微生物生长的条件，从而选择出分解尿素的细菌。【例1】通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作有关的叙述中，不正确的是()A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B．取104、105的土壤稀释液0.1mL，分别涂布于各组平板上C．将培养皿倒置，37℃恒温培养24～48小时D．选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数【解析】检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，取104、105、106稀释度的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时，在确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的平板进行计数。【答案】D【例2】下面是本课题将用到的培养基配方，请根据下表回答问题。编号成分含量①KH2PO41.4g②Na2HPO42.1g③MgSO4·7H2O0.2g④葡萄糖10.0g⑤尿素1.0g⑥琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL(1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是________，提供氮源的是________。(2)绝大多数微生物都能利用________，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解________。(3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？【解析】碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择的原则是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。【答案】(1)葡萄糖尿素(2)葡萄糖尿素(3)该培养基对微生物具有选择作用。以尿素作唯一氮源的培养基可以分离到能产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。知识点二统计菌落数目(1)显微镜直接计数法①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。②方法：用计数板计数。③缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作稀释涂布平板法——统计活菌数③计数规则选择菌落数在30～300的平板计数若某两个或多个稀释浓度下获得的菌落数均符合条件时，再看两者菌落数的比值，若小于2，则取两者的平均值；若大于2，则取小者④计算方法：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×MC：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V：涂布平板所用稀释液的体积M：稀释倍数(3)设置对照：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。(4)细菌分离与计数的实验流程土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数。即：土壤取样：从距地表约3～8cm的土壤层取样测细菌数：选用104、105、106倍稀释测放线菌数：选用103、104、105倍稀释测真菌数：选用102、103、104倍稀释细菌：30～37℃1～2d放线菌：25～28℃5～7d霉菌：25～28℃3～4d注意：分离分解尿素的细菌的实验设计原则(1)设立平行重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作平行重复组，增强实验结果的说服力与准确性。(2)对照原则①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。【例3】下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误．．的是()A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数【解析】检测土壤中细菌总数是以空白培养基培养稀释液后所出现的菌落数目来计算的。操作的第一步是配培养基。配培养基时要注意营养物质全面均衡，调pH等。牛肉膏蛋白胨属天然培养基，灭菌后可直接用于微生物培养。为便于计数通常要对菌液进行稀释。而且要设置一空白对照。避免培养基自身污染造成误差，将平板倒置也是为了防止污染影响实验结果。培养条件是细菌的最适温度37℃。所以A、B、C项正确。在确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的一组平板为代表进行计数。所以D不对。【答案】D【例4】自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。步骤：①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。②用稀释涂布平板法接种样品。③适宜温度下培养。结果分析：(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是________。A．一个平板，统计的菌落数是23B．两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25(2)一同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2mL)________。(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为_________(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？【解析】(1)计数微生物时可选取多个菌落数相差不大的平板计数求其平均值。(2)23.4÷10－6÷0.2＝1.17×108(个)。(3)因为菌落可能由1个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。【答案】(1)D(2)1.17×108(3)多当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落(4)不能。因为不能排除杂菌来自培养基或来自培养过程。知识点三实验中的对照实验对照实验是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是对照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。为了做到正确的鉴别，实验中通常设置对照组。为使实验可信度高，实验组严格按实验要求操作，再设几个对照组，如用未严格消毒的培养基，混入其他含氮物质的培养基等，其他条件都相同，经培养、计数，以排除可能影响实验结果的因素。【例5】用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是()A．未接种的选择培养基B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D．接种了的选择培养基【解析】将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的原则是单一变量原则。【答案】C知识点四实验操作1．实验流程取样→梯度稀释→涂布平板→培养、观察→统计菌落数目。2．实验步骤(1)土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。选用铲子铲去表层3cm左右的土后，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。(铲子、信封预先灭菌)(2)制备选择培养基：配制牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。其中分解尿素细菌的选择培养基配方如下表。制备5个牛肉膏蛋白胨培养基，作为空白对照；15个选择培养基，分五组进行实验，每组三个。样品稀释倍数预定在103～107。培养基组成提供的主要营养物质KH2PO41.4g，Na2HPO42.1g，MgSO4·7H2O0.2g提供无机盐葡萄糖10.0g碳源尿素1.0g氮源(唯一)碳源琼脂15.0g凝固剂加H2O定容至1000mL氢、氧元素的供给(3)稀释涂布与培养观察(见下图)①样品稀释：将称取的样品土10g，加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1mL转移到盛有9mL生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至106