叶绿体色素提取和分离实验失败原因初探

摘要文章分析叶绿素提取和分离实验失败原因有三:(一)提取液色素含量低;(二)色素提取困难;(三)样点或样线浓度不均。同时,本文还提出实验改进的几点设想。关键词叶绿素提取分离“叶绿体色素提取和分离”实验,是三年制专科生化系《植物生理学》课程中必做的一个实验,也是高中《生物》四个必做实验中难度最大的一个。该实验的目的,在于验证叶绿体色素的种类及性质,因而十分重要。然而99年10月97级生化20个组次的实验均告失败,未能呈现分离的色带。查阅教材《植物生理学》(涂大正主编,东北师范大学出版社),实验完全按照书上实验内容所列步骤进行,所用药品亦未失效。笔者翻阅了一些资料,重新设计实验,终于取得了成功,找到了失败的原因。1、实验失败的原因教材上本实验的步骤是:称取新鲜叶片10克,加少量CaCO3粉及95%酒精(或丙酮),研磨,过滤。取一滤纸条,在一端点不超过0.5cm宽的样线,卷折,有试样端塞入滤纸中心孔中,层析。按此步骤做,实验未能成功。1.1提取液色素含量低是导致实验失败的主要原因。笔者在学生做实验之前曾预做,效果明显。学生按同样方法操作时效果却很差。笔者当场重做,亦未出现明显色带。经其它教师提醒,方明白其中原由。预做时,所用菠菜叶放置时间较长,菠菜叶中的水分已大为减少。提取液中叶绿素含量高,故层析效果明显。而学生做实验时,取用的是新鲜菠菜,叶表面尚有明水,故提取液中叶绿素含量较低,为验证这一点,笔者曾取10克市售新鲜菠菜叶烘干,只得1.5克干叶,其余8.5克均为水份。1.2色素提取困难,是导致提取液色素含量低的原因。从实验中得到的结果是,用干叶粉提取叶绿体色素,滤液为深绿色,滤渣为浅绿色;而用新鲜叶片研磨过滤,滤液为浅绿色或黄绿色(或清或浊),滤渣为深绿色。笔者曾做过这样一个试验,将新鲜叶片的滤渣置于烧杯中,加入少量NaCl重新加入酒精或丙酮,搅拌过滤,滤液为深绿色,取用做层析,效果不错。试析原因,有以下两点:1.2.1水分的存在增加了提取叶绿素的难度。叶绿体色素不溶于水,溶于酒精、丙酮等有机溶剂。色素溶于有机溶剂时,各色素分子分散在有机溶剂分子之间,它们之间的作用力是很弱小的范德华力,色素可以很容易被提取出来。而当水和乙醇相遇时,水份子和乙醇分子靠氢键相互吸引。这样,一方面水分子和乙醇分子之间的引力远大于色素分子和乙醇分子之间的引力,乙醇分子被水分子所吸附。水分越多,乙醇分子被吸附的就越多。另一方面,水分子又极力排斥色素分子。竞争的结果,水分子吸附部分乙醇分子,这些乙醇分子就不能与色素分子结合,导致部分乙醇不能溶解色素,水分越多,叶绿体色素的提取越困难,过滤时,留在滤渣中的色素也越多,滤渣呈深绿色。1.2.2胶体的吸附也增加了提取叶绿素的难度。植物细胞的细胞质是一种胶体物质。在实验中,细胞虽然被研碎,但胶体依然存在。由于胶体有较强的吸附性,色素被胶体所吸附,因而不能被有机溶剂所提取,所以滤渣中还含有大量的叶绿素,呈深绿色。1.3样点或样线不整齐,色素浓度不均是实验失败的原因之三。分离出的色带不完整,不整齐,清晰度差的原因,主要是样点或样线上色素的浓度不均衡造成的。由于浓度的不同,色素展开的时间不同,随展层液移动的距离也不同,表现出不完整和不清晰。2.对实验方法的改进2.1材料的选择恰当选用实验叶片,是获取高浓度滤液的保证。从叶绿体色素的种类和含量看,大部分高等植物的叶片都可用。但从研磨的角度看,选材是否得当关系着实验能否顺利进行。应选择表面没有或少有蜡质层的叶片以及输导组织不发达的功能叶。为降低成本,同时还要考虑选择常见,数量多,且易得到的叶片。2.2材料的处理减少提取液中水分的关键就在此步。将选择好的材料去掉叶柄,放置一段时间,阴干或风干到一定程度。如有条件烘干则更好。取2—3克(烘干的叶片取1.5克)粉碎,置研钵中。2.3材料的研磨加入少量(经数次摸索,半匙即可)石英砂和无水CaCO3,NaCl0.5克,乙醇5ml(或丙酮2ml),迅速研磨。这里,加入石英砂的目的是加快研磨,促使细胞破裂;加入(无水)CaCO3是为了中和细胞液中的有机酸,防止叶绿素的破坏;而加入NaCl则是为了沉淀胶体,释放色素。2.4提取液的过滤快速研磨几分钟,材料呈绿色糊状。再倒入10-15ml乙醇(丙酮4-6ml),搅拌均匀即可为加快过滤的速度,可用薄脱脂棉一小片代替滤纸。2.5滤纸条的制备准备宽3-5cm的滤纸条,长度略短于实验所用的大试管的高度,一端对称剪去两个小角。对滤纸条的质量要求是:①干燥,手感不潮湿;②剪取时纸的纹路应与长度方向一致;③平整洁净,无污点;④边缘不能有纸毛。2.6点样由于条件的限制,这一步骤使用的符合条件的玻璃毛细管不易拉成和找到,致使划出的样线不均,浓度不等,影响了层析效果。可采取以下方法:滴1-2滴提取液于一干净的载玻片上,然后小范围涂抹均匀,让提取液在载玻片上呈薄层附着。将准备好的滤纸条沿去角一端的梯形长底边取折缝对折轻压,然后用折缝轻蘸一下载玻片上的色素提取液,风干后重复几次,就可得到一条又细又整齐,而且浓度一致的样线。2.7色素的分离取大试管及相应的橡皮塞。将橡皮塞用刀切—1cm深的切口。把滤纸条未点样端夹在切口中。往大试管中注入3—5ml展层液,将滤纸条伸入大试管中,塞严橡皮塞。注意,滤纸条去角端应浸入展层液中,但展层液液面不能浸没样线。如外界温度较低,可用手捂住试管下端或水浴。这样,短时间就会出现明显的色素带。3.关于实验改进的几点补充3.1有资料显示,提取色素时如果含水量过大,可加入能把有机溶剂和水分开的盐类(如NaCl,CaCl2,K2CO3),就能提取到大量的色素。其原理,在于盐在水中电离成离子,这些离子的半径较小,且带有正负电荷,和水的亲合力大于有机分子与水的亲合力,故盐对水分子的吸引力大于水分子和有机溶剂分子之间氢键的力量,所以能把水和有机溶剂分开。3.2加入上述盐后,有机溶剂溶解色素在上层,盐、粗渣和水在下层,可直接将上层液取出使用,无须过滤。3.3将烘干叶片粉碎后加入乙醇搅拌几分钟,过滤,也可得到较高浓度的色素提取液,免去研磨步骤,省工省料省时。参考文献:①涂大正等主编,植物生理学.长春.东北师范大学出版社.1991.342.②任延红.“叶绿体色素的提取和分离”方法改进.中学生物教学.1997.1:38.③张孝.关于叶绿体中色素的提取和分离实验的改进.生物学教学.1994.3:33-34.④吕维栋.叶绿体色素提取方法的几个问题.生物学教学.1996.1:27-28.⑤郭学民.叶绿体色素提取实验的改进.生物学教学.1996.1:28.⑥李志刚等.叶绿体色素提取.分离实验的难点分析.生物学教学.1996.5:26-27.⑦李翔腾.用于叶粉提取叶绿体中的色素.生物学通报.1998.33(5):11.⑧华东师范大学生物系植物生理教研室主编.植物生理实验指导.北京.人民教育出版社.1980.78.