提取RNA及PCR步骤

一、提取组织RNA1．准备好冰盒、1.5mlEP管(无RNA酶)、剪刀及镊子（需消毒，再用灭菌纯水和DEPC水洗净）、钻头、灭菌纯水等。2.取出冻存管，剪取约0.5cm放于EP管。3.即刻加1mltrizol，剪碎至无可见微粒，静置5-10min4.加0.2ml氯仿，盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s,15-30℃静置2-3min5.离心12,000g*15min,2-8℃6.EP管内分三层，取上层液相置于新EP管7.加0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，15-30℃静置10min8.离心12,000g*10mim,2-8℃9.弃上清（不用吸净残液），加1ml75%乙醇清洗沉淀(乙醇用前需4℃预冷)10.离心10000/7500g*5min,2-8℃11.去上清（需吸净残液），干燥RNA(超净台内风干至白色变透明状，约1h以上),加10—12ulDEPC水解（约1h以上），测浓度，-80℃保存。PS：1.所用枪头、EP管、DEPC水、纯水、剪刀、镊子均需灭菌。2.75%无水乙醇用前需4℃预冷。3．若最后提取出的RNA量多，可加30ulDEPC水溶解;若难以溶解，可置于55℃水浴加热。4．破碎：取组织勿过多，否则难以破碎，亦难以提取RNA；一个样品破碎过后需清洗，顺序为：酒精棉球擦洗→DEPC水洗→拆分清理→纯水洗→棉球吸去钻头残液。5.破碎仪的使用：打开前先保证已调于低档，将钻头浸没于样品中，切忌在空气中空转，从低到高慢调，同时上下轻移样品，注意力度控制，避免液体飞溅误伤；同时注意听破碎时的声音，若有尖锐声音发出，说明有异物卡住钻头，需停止查看。二、提取细胞RNA1.细胞加1mltrizol裂解5min,15-30℃2.加0.2ml氯仿，盖紧EP管，上下倾倒，混匀15s,15-30℃静置2-3min其余步骤参见提取组织RNA的第5步开始PS：1.新EP管需用无RNA酶EP管。2.操作过程需时刻注意避免污染，EP管取放时勿碰到内壁及管口，每步操作前需适时擦拭双手及枪管。3．RNA勿照紫外。4．DEPC水量较关键，需保证RNA充分均匀融解，若可用肉眼看到白点，可多加至20ul。三、测RNA浓度：准备96孔板→开盖，盖子朝天放→加98ulEDPC→预读（setting：OD值260；选中区域；选“预读”）→“Read”→结果复制→拿出孔板，再加2ulRNA→直接“READ”→复制结果（复制后的结果与软件上的不同，此为已经相减后的数据）→重设条件（setting：OD值260280；选中区域；“Normal”；“Delete”；“OK”）→“READ”→复制结果→数据处理：CRNA(ug/ml)=“Normal”值—预读值CRNA(ug/ul)=50(稀释倍数)*40（OD值）*1/1000*CRNA(ug/ml)=2*CRNA(ug/ml)VRNA=1ug（可变）/CRNAVH2O=V（总体积由说明书得）—VRNAPS：1.C260/C280的比值意义范围为1.8—2.0,小于1.8可能是蛋白含量较多，大于2.0可能是DNA含量较多2．往孔板加液时，勿使枪头顶端碰触孔板内壁，以防损伤内壁包被液3.样品多的话，不用分别加入，可先配总量，再分装四．反转录PCR1．加：1uloligo(dT)1ng—5ug总RNA1ul10mMdNTP混合物灭菌水（DEPC）加至11ul（12-1）2．混合物：放入PCR仪→65℃，5min→结束后迅速移至冰上3．加：4ul5*buffer2ul0.1MDTT轻混匀→PCR→37℃，2min4.室温下加入1ulM-MLV→轻混匀（防气泡）5．PCR仪：37℃，50min+70℃,15min+4℃,5minPS:1.冰上操作，严格遵守无RNA酶操作2．加液时，枪头贴近液面快速打出液体，提离液面后放松五．Q-PCR1.加液：SYBR5ul（ROX0.2ul（eppendorfAGPCR无需加此物））Primer0.2﹢0.2ulcDNA0.5ulH2O4.1ul2.离心：A、8联管：样品对称离心→打开离心机总开关→打开盖子→对称放入样品→盖面上的白点对准机孔边的标签盖好→按“启动”→转速升到“1100”左右→按“停止”→等转速降至“60”左右开盖取出→仪器复位B、96孔板：水平离心，3000rpm,3-5minPS：加液或转运样品时均需用到冰盒。3.实时荧光定量PCR的使用（eppendorfAGPCR）：A．仪器结构：上部为荧光检测仪，下部为热循环仪；银质模块，光源为LED；2个光电倍增管（CPM检测器）；4通道检测：520nm,550nm,580nm,608nm；B.备注：①运行前需预热15min,PCR仪可过夜运行。②此仪器需3个月校正一次，用DDwater（去离子水）20ul，默认校正温度为60℃。③默认热启动，每分钟升温8℃，可1次自检/15min。④关于指示灯：闪烁表明在运行；亮绿灯表明在保温；亮桔灯表明在自检。⑤软件登录密码为E/e；连续开启软件，间隔时间为1-2s；此仪器无需用ROX作为校正荧光。⑥此程序可根据已完成循环的荧光信号（原始数据）进行数据分析，在反应结束前即可观察结果。⑦设置条件时一般选择相对定量，即蓝色桶状图标；红色桶状图标为绝对定量。C．软件操作：开启电脑→开PCR仪→双击软件图标→口令“E/e”→点击软件界面上端菜单左2进入操作界面→建立用户：点击上左6，选第一个，点击进入设置（选择管理员用户）→等待指示灯由黄变绿→进入界面“platelayout”进行设置，“Filter520nm”:“SYBR”；“SampleVol”:上样体积；“background”:“Axygen8-strips”(80管)→放入样品（记住安放顺序，盖紧盖子且勿污染盖面，轻放样品以防产生气泡或产生内壁残液）→点住鼠标左键，选定样品区域，点击右键，选择“unkown”（相对定量），标记引物名称→选定内参区域，点击右键，选择“Standard”（相对定量），标记内参名称→转换界面进入“PCRProgram”，设置反应体系（鼠标移至目标区域，点击右键，选“Insert”,插入所需项）；选中下方的“TSPHeatedLid”及“Impulse”；“Temp.Mode”：“standard”→设置完后需保存，在点击“运行”反应体系：95℃2min94℃15s↘40*(荧)60℃25s↗溶解曲线(点击鼠标右键→“Insert”→“Melting”)：95℃/9415s60℃15s荧20min95℃/9415sD．结果分析：调节基线，选择阈值（标准：同样品两孔之间的阈值差值△≤0.35）→取样品及其副孔的阈值平均值→平均值-相应内参的阈值=相对值→得出的最大相对值逐一去减其他的相对值→得出的结果设为X，运用公式Power(2,x)得出最终的数据