3-2菊花的组织培养

菊花的组织培养菊花是菊科菊属的多年生宿根草本植物,是我国的传统名花。长期以来菊花采用分株、扦插等无性繁殖方法进行繁殖。但是传统的繁殖方法易受环境影响,繁殖周期长。植物组织培养具有增殖效率高、繁殖速度快等特点,可以用较短的时间和较少的空间生产出大量的试管苗。一、项目介绍二、实验原理1、植物组织培养指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其生长、增值、分化成完整植株的技术。二、实验原理2、植物细胞的全能性植物细胞具有全能性，即生物体的细胞具有使后代细胞形成完整植株个体的能力。植物细胞表现出全能性的条件：①离体状态②在一定的营养物质、激素和其他外界条件（光照、温度）3、细胞分化在植物的个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。基因的选择性表达形成各种不同的组织和器官③结果：②实质：①定义：二、实验原理离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织根芽植物体三、实验过程请阅读课本：32页图3-1。外植体：离体的植物器官或组织片段①脱分化（去分化）：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。相关概念②愈伤组织是通过细胞分裂形成的，其细胞排列疏松而无规则，高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化根芽植物体三、实验过程请阅读课本：32页图3-1。②愈伤组织是通过细胞分裂形成的，其细胞排列疏松而无规则，高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。①脱分化（去分化）：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。③再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫再分化。相关概念离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化根芽植物体三、实验过程请阅读课本：32页图3-1。营养、温度、PH、激素营养、温度、PH、激素、光照影响植物组织培养的因素不同植物的组织培养难度不同1、外植体的选取同一种植物的不同组织培养难度不同影响植物组织培养的因素2、培养基的配制(MS培养基)影响植物组织培养的因素大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素等2、培养基的配制(MS培养基)你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养。甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞对特殊营养的需求。影响植物组织培养的因素3、不同植物激素浓度的使用顺序和使用量使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高影响植物组织培养的因素3、不同植物激素浓度的使用顺序和使用量生长素细胞分裂素比值结果比值高时促根分化，抑芽形成比值低时促芽分化，抑根形成比值适中促进愈伤组织生长总结植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素再分化植物组织培养过程示意图上面的示意图中还有什么地方不够完善的？没有进行灭菌处理，试管也没有做密封等。①细菌污染：菌斑呈粘液状，界限比较明显，一般接种后1－2天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。植物组织培养的污染②真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子接种后3－10天才能发现。主要是霉菌污染。植物组织培养的污染1、外植体带菌2、培养基及接种器具灭菌不彻底3、接种操作时带入4、环境不清洁污染途径4、消毒：在培养的整个过程中，都需要是一个无菌环境影响植物组织培养的因素5、pH、温度、光照菊花：pH=5.8、温度控制在18—22℃、每日光照12h制备MS固体培养基外植体消毒接种培养栽培实验具体操作过程移栽实验具体操作过程（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备。1、配置各种母液①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量实验具体操作过程2、配置培养基①定容②调PH③培养基的分装实验具体操作过程实验具体操作过程3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌。注意：①温度为121℃时，维持15-20分钟。若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。②某些生长调节剂如赤霉素等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能同培养基一起高压灭菌，而需要进行过滤灭菌。实验具体操作过程1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒考虑的因素说明外植体的年龄选择幼嫩的组织或器官作为外植体外植体的大小选择大小适中的作为外植体外植体所在部位选择芽尖、根尖或幼嫩的茎作为外植体外植体外观形态选择表面相对光滑易消毒的作为外植体2、表面消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右②酒精处理—无菌水冲洗用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗③氯化汞（升汞）—无菌水冲洗取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液实验具体操作过程流水冲洗实验具体操作过程实验具体操作过程（三）接种1、接种室消毒污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒，酒精擦洗工作台并用紫外线照射20分钟。2、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。实验具体操作过程插入时应注意方向，不要倒插，茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分。3、材料的切取和接种实验具体操作过程进行外植体的接种接种前用体积分数为70%的酒精将工作台擦拭一遍，打开紫外灯照射20分钟。工作台消毒后，首先点燃酒精灯。酒精摇动倾倒酒精无菌水冲洗升汞消毒倾倒升汞无菌水冲洗特别提醒：接种过程必须始终在酒精灯旁进行，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，操作过程中避免双手从培养皿上方移动。特别提醒：每瓶内接种材料不宜过多（建议4-5个），彼此之间留出一定空间，从而避免互相污染。思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。实验具体操作过程实验具体操作过程（四）培养无菌箱中培养，定期消毒，保持适宜的温度，光照接种后的锥形瓶放在培养箱或培养室中培养。培养条件：18-22℃，每日光照12小时。实验结果5-7天，外植体膨胀、生长，颜色变浅，若出现染菌，及时转瓶。实验结果2-3周，愈伤组织开始形成。染菌5-7天后染菌1-2周后实验结果3-5周之后，诱导出的新叶片和芽。实验具体操作过程（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间实验具体操作过程珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培。蛭石是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。其晶体结构为单斜晶系，从外形上它看上去像云母。蛭石是一定的花岗岩水合时产生的。它一般与石棉同时产生。由于蛭石有离子交换的能力，它对土壤的营养有极大的作用。蛭石的化学式为（Mg，Ca）0.7（Mg，Fe，Al）6.0[（Al，Si）8.0]（OH4.8H2O）。实验具体操作过程（六）栽培幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花幼苗的移栽和栽培思考在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）4、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。无菌条件如何保证？需要保证无菌条件步骤关键操作培养基及实验器材的灭菌•高压蒸汽灭菌•灭菌干燥后直接拿到无菌操作台中外植体的消毒•酒精、升汞、无菌水彻底清洗接种的无菌操作•始终在酒精灯旁进行•每次使用器械后，都需要浸泡在95%的酒精中•每次使用器械前，都需要用火焰灼烧灭菌•操作过程中避免双手从培养皿上方移动•每瓶内接种材料不宜过多培养箱中的培养•观察时不打开封口膜•手持锥形瓶锥形瓶观察时正握•发现染菌外植体，及时转瓶，打开封口膜前先高压蒸汽灭菌三、课题延伸1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季总结植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素再分化本课题内容小结菊花组织培养基础知识实验操作植物体的组织培养影响组织培养的因素细胞分化细胞全能性组织培养过程营养激素环境条件MS固体培养基制备外植体消毒接种培养移栽栽培