3植物组织培养技术[1]

专题3植物组织培养技术1、原理:2、必要条件：植物细胞的全能性细胞离体一定的营养物质、激素和其他外界条件外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官植物组织培养技术3、细胞的全能性①定义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性②原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因已分化的植物细胞，仍具有全能性③实例受精卵生殖细胞体细胞④全能性的比较:1）、培育无病毒植株2）、培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4)、基因工程中亦需到植物组织培养的方法4、植物组织培养的应用：3）、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题•课题目标•说明植物组织培养的基本原理，学习植物组织培养的基本技术，进行菊花或其他植物的组织培养。•课题重点与难点•课题重点：植物组织培养过程中使用的无菌技术。•课题难点：植物组织培养过程中使用的无菌技术。课题1：菊花的组织培养一、基础知识1、植物的组织培养（1）细胞的分化①概念：在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程②过程：如：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统③特点：（2）稳定性：细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的（3）全能性：已分化的细胞，仍具有发育的潜能（1）持久性：是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度⑤原因：基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果④结果：形成不同的细胞和组织2、植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素再分化植物细胞培养脱分化：指已经分化的植物器官、组织或细胞,当受到创伤或进行离体(也受到创伤)培养时,已停止分裂的细胞,又重新恢复分裂,细胞改变原有的分化状态,失去原有结构和功能,成为具有未分化特性的细胞。再分化：已经脱分化的细胞在一定条件下,又可经过愈伤组织或胚状体,再分化出根和芽,形成完整植株,这一过程叫作再分化。愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞菠萝的愈伤组织愈伤组织2、影响植物组织培养的因素（1）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养，如芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季（2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基MS培养基主要成分包括：A、大量元素:N、P、K、Ca、Mg、S等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等C、有机物:如氨基酸、烟酸、肌醇、维生素，蔗糖等D、植物激素①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素（3）植物激素的影响使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞即分裂也分化同时使用分化频率高②生长素和细胞分裂素作用生长素细胞分裂素：有利于根的分化生长素细胞分裂素：有利于芽的分化，抑制根的分化生长素细胞分裂素：＝促进愈伤组织生长③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响（4）pH、温度、光照pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每日用日光灯照射12h生长素细胞分裂素：讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。植物组织培养过程离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化芽根植物体组织培养实验过程简图移栽制备MS固体培养基外植体消毒接种培养栽培二、实验操作移栽MS培养基的配制操作步骤（1）MS培养基母液的配制:MS培养基含有十几种化合物，配制不方便也难称量准确，可将培养基中的各种成分扩大一定倍数分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。(母液配制见下表)（2）MS（1000mL）培养基的配制:按比例分别取适量各种成分的母液，加入烧杯，称取蔗糖30g，琼脂7g，加水并加热使琼脂溶解，按照需要的浓度分别加入激素，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl溶液调节pH至5.8~6.0。将配好的培养基迅速分装至组培瓶中，拧上盖子，放入灭菌锅121℃，灭菌20min。③培养基的分装注：由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌植物组培具体操作步骤（1）取材：取菊花生长旺盛的嫩枝(外植体不能太小，否则会影响愈伤组织的形成)。（2）消毒与修剪外植体：①流水冲洗后,加少许洗衣粉刷洗,流水冲20分钟;②放入70﹪酒精中摇动2~3次,持续6~7秒,无菌水冲洗2~3次，用无菌吸水纸吸干;③放入质量分数为0.1%氯化汞溶液中浸泡1～2分钟,无菌水冲洗2~3次，无菌吸水纸吸干。（3）接种常用灭菌剂使用浓度及效果比较表植物组织培养消毒与接种示意图接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。（4）培养1、愈伤组织的培养从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，见不见光因不同植物而异，菊花在见光条件下愈伤组织长的更快。胡萝卜无光才长得好。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养，约20d2、试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗培养（五）移栽1、打开封口膜2、清洗转移（六）栽培3、移栽材料的移栽及温室培养：炼苗：先在外界环境闭瓶锻炼3天，再开瓶锻炼3天（以培养基上开始长出菌为宜）。移栽：去净培养基，可先在灭过菌的珍珠岩或蛭石上培养使根系发达再转移到土壤中。菊花炼苗菊花移栽苗1、外植体带菌2、培养基及接种器具灭菌不彻底3、接种操作时带入4、环境不清洁植物组培污染途径污染的预防措施（一）防止外植体带菌（二）保证培养基及接种器具彻底灭菌（三）操作人员严格遵守无菌操作规程（四）保证接种与培养环境清洁1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）4、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。思考：在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？组织培养原理过程意义利用植物细胞的全能性快速繁殖，培育无毒植株，培育作物新品种根芽植物体离体植物器官、组织或细胞(脱分化)愈伤组织(再分化)植物组织培养小结:操作条件含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等•练习•1.答：植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。•2.答：外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。影响植物组织培养的影响因素及注意事项影响植物组织培养的几个因素•植物的材料•培养基•植物激素•pH值•外界因素（温度，光照，通气状况，材料处理等）【注意事项】1、实验所使用的器材必须要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；2、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机物质和铁盐溶液配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它两种种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；3、pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值；4、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀死。5、所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。组织培养实验室设置及设备介绍（1）实验室设置组织培养实验室设置简图（2）组培相关设备仪器介绍电子天平纯水机酸度计高压灭菌锅干燥箱摇床超净工作台数码显微镜数码显微镜又叫视频显微镜，它是将显微镜看到的实物图像通过数模转换，使其成像在显微镜自带的屏幕上或计算机上。我们可以对微观领域的研究从传统的普通的双眼观察到通过显示器上再现，从而提高了工作效率。培养架恒温光照培养箱非洲菊雏菊金盏菊波斯菊百日草孔雀草