msc对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的影响

项目类别申报学科代码1科学部编号CC03030310国家自然科学基金申请书项目名称：MSC对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的实验研究申请者：所在单位：邮政编码：410016通讯地址：重庆市渝中区医学院路１号电话：4传真：6申请日期：2000年12月国家自然科学基金委员会一九九七年制填报说明一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸，于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件），由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委一份原件。三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项目组成员参加研究：—在读（含在职）研究生—已离退休的科研人员—申请单位的兼职科研人员五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请（含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重点项目、重大项目），不得超过两项。六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家名单（姓名与单位，3人以内），密封于信封中，钉在申请书原件封面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将对此信息保密。八、国家自然科学基金委员会通讯地址：北京市海淀区花园北路35号东门邮政编码：100083一、简表－1－研究内容和意义摘要通过MSC体外培养，转化为神经干细胞，进而基因转染，体内移植，诱导分化等方法探索对先天性巨结肠症动物无神经节细胞段进行神经支配重建的途径和效果。本研究的完成将采用细胞工程原理和方法代替手术方法,从根本上改进先天性巨结肠症的治疗及预后，丰富临床神经生物学的发展。主题词1.主题词数量不多于三个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）。中文MSC神经干细胞先天性巨结肠症英文mesenchymalstemcell/neuronalstemcell/aganglionicbowel简表填写要求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称——应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字(包括标点符号）。基础研究——指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究——指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。申报学科——申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。申请金额——以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月——起始时间从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的12月。所用实验室——系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。所在单位名称及代码——按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：中国航天工业总公司第七○一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数——指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿拉伯数字表示。项目组主要成员——指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义——摘要与主题词均录入软盘。－2－二、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景。先天性巨结肠症（Hirschsprung’sdisease，HD）是小儿外科领域内的一种常见性疾病，发病率为1/2000~1/5000。对HD临床及基础研究一直是小儿外科研究的热点之一。此疾病的发生是由于多种原因使胚胎期神经嵴细胞在消化道移行受阻，结肠壁肌间神经节细胞缺如，病变结肠痉挛收缩，肠内容物排出受阻，近端肠管继发性扩张形成巨结肠，影响儿童健康成长。自发现HD的病因以来，HD的治疗主要依靠手术切除远端无神经节细胞段，手术方式较多，由于各种术式固有缺陷，目前仍存在各种并发症，影响HD患儿术后恢复［１］。寻求更为有效及安全的针对HD的治疗方法，一直是国内外小儿外科工作者努力的方向。在临床及科研工作中我们注意到细胞疗法（celltherapy）近年来已成为治疗多种疾病的新策略，在替代，修复或加强受损的组织或器官的生物学功能方面有巨大作用。细胞疗法中应用的靶细胞之一，神经干细胞，目前已成为研究热点。传统的发生生物学认为人体神经细胞一经受损就永远不能再生新的神经元。然而随着神经干细胞的发现，受损神经细胞不能恢复的观点正在发生变化。神经干细胞是一种终身具有自我更新能力的细胞，其子细胞能分化产生神经系统的各类细胞，干细胞通过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞具有有限的自我更新能力，并自发分化产生成神经元细胞和成胶质细胞等，从而生成神经元及神经胶质细胞。已有研究表明神经干细胞具有潜在多向分化能力，能在一定条件下定向分化，具有较强的增殖能力，移植入成体神经组织后易于存活，目前神经干细胞在损伤神经组织，细胞的修复方面已显示出良好的应用前景[2]。HD病因为胚胎早期神经嵴细胞移行受阻的结果，以往我们对HD的研究中也发现HD病变肠段不仅存在神经节细胞异常，神经胶质细胞也表现出异常，进一步支持了HD病因系胚胎早期神经嵴细胞移行异常的结果。对于这种病变肠段无神经节的异常神经支配可否通过神经干细胞进行移植修复呢？结论是肯定的，Natarajan等在体外实验中观察到正常鼠的神经嵴细胞可在体外修复培养中的RET.K–突变鼠(一种HD动物模型)病变肠段神经支配，且前瞻性地指出了神经嵴细胞移植可能成为今后先天性巨结肠症的治疗手段[3]。目前的问题是在临床实践中诊断的HD患儿均在出生后，此刻神经嵴细胞分化成熟，－3-1－且此类患儿病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等细胞外基质变化，单纯的神经嵴细胞移植一方面神经嵴细胞来源受限，另一方面能否在体内改造病变肠段的病理变化，仍需进一步研究。近年来干细胞的基因修饰治疗发展较快，国外有人发现将表达神经营养因子的神经干细胞直接种植于受伤的脑组织中，能促进神经功能的恢复。神经干细胞在受到碱性成纤维细胞因子（FGF-2）和上皮细胞生长因子（EGF）刺激时可分化出神经元和胶质细胞，EGF可维持神经干细胞的生成，FGF-2对干细胞的分化起重要作用；有很多神经因子（如血小板生长因子，转化生长因子等）对神经干细胞的分化起着协同作用。诱导分化剂维甲酸对神经干细胞也有诱导分化作用[3]。对于HD病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等变化的现象，我们注意到纤溶酶原激活因子（PA）能激活纤溶酶原，水解纤维蛋白，及细胞外基质中的纤连蛋白(fibronectin,Fn)，层粘连蛋白（laminin，Ln），基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinaseenzyme,MMP）能分解周围组织—细胞外基质，如将PA，MMP的cDNA转染修饰神经干细胞将有可能对HD病变段的病理变化进行改造，有利于神经干细胞生长，发育。通过探索影响神经干细胞移植，生长，分化的分子机制，结合基因工程技术，将可为神经干细胞移植治疗成功创造条件。鉴于神经干细胞的多向分化潜能，在大脑，脊髓中的损伤修复研究中令人鼓舞的发现，自体造血干细胞等分化为神经干细胞可能性的提出[4]（此将为神经干细胞自体移植提供一个很好的来源），以及神经干细胞目前被认为是一种更优于成纤维细胞的基因治疗的载体细胞[5]，针对上面的问题我们提出如下假说：如同神经干细胞移植在恢复受损大脑，脊髓神经功能上具有良好的应用前景一样，通过各种人工方法修饰后，神经干细胞移植有恢复HD病变肠段的正常神经支配的可能。细胞移植虽然已被认为对于修复神经组织是有效的治疗方法，但目前使用的细胞多取自胚胎，这样一方面细胞来源有限，另一方面存在异体免疫排斥作用。神经干细胞可以在体外大量增殖，但目前主要在海马和室管膜下层发现有神经干细胞分布，这样造成了神经干细胞来源困难。骨髓中有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）。前者的移植已成功用于临床治疗白血病，但其移植需要获得足够数量的造血干细胞，并且造血干细胞体外扩增存在困难。MSC易于从骨髓中分离，体外扩增简单，长期培养过程中能保持多向分化潜能。近期美国学者Woodbury等在体外实验中成功地将源于成年大鼠及人骨髓MSC转化为神经干细胞,并进而分化为神经元[6]。此研究结果很好地解决了神经干细胞来源困难的问题，为今后神经干细移植治疗多—3-2—种神经系统疾病打下了基础。总之，随着当今干细胞研究的深入，探索通过MSC转化为神经干细胞恢复小儿外科常见疾病（先天性巨结肠症）正常神经支配的方法具有重要现实性及可能性。美国«时代»周刊曾将人类胚胎干细胞（ES细胞）和胚胎生殖细胞（EG细胞）建系研究成功列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。由此激发了人们对ES细胞，骨髓干细胞，神经干细胞定向分化的研究。将MSC,神经干细胞定向分化，移植的研究引入到HD这一小儿外科常见病的治疗研究中，探索MSC，神经干细胞克隆、定向分化、移植对于HD治疗方法，可为发育生物学积累宝贵的资料；采用细胞工程原理和方法，通过MSC，神经干细胞移植重建HD病变段的正常神经支配方法的研究成功，在临床上将可以让HD患儿免于手术，使HD的治疗发生根本性的改观。该课题的完成除能为儿童的健康成长做出巨大贡献，并能带动本地区整个小儿外科水平的发展，提高本地区小儿外科在国内及国际上的地位，为祖国西部大开发战略的顺利进行贡献力量。参考文献(1)陈雷玲，胡廷泽，朗诗明，等。320例先天性巨结肠症的诊断与治疗分析。华西医科大学学报，2000，31(2)：274-27(2)KathrynS.Embryonicstemcellsusedtoremyelinateinjuredratspinalcordneurons.Lancet,2000,355(9218):1890(3)McCafferyP,DragerUC.Regulationofretiniocacidsignalingintheembryonicnervoussystem:amasterdifferentiationfactor.CytokineGrowthFactorRev.2000,11(3):233-249(4)NatarajanD,GrigoriouM,Marcos-GutierrezCV,etal.Multipotentialprogenitorsofthemammalianentericnervoussystemcapableofcolonizingaganglionicbowelinorganculture.Development,1999,126:157-168(5)刘平，卢亦成，朱诚。中枢神经干细胞。中华神经外科杂志。2000，16（3）：196-198(6)W