动物组织培养-1

目录3.1动物组织培养的基本概念3.2动物组织培养的技术3.3动物组织培养的技术应用3.4动物组织培养的进展动物细胞特点:无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化3.1动物组织培养的基本概念•定义：从动物体内提出组织，于模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。•分类：•器官培养•组织培养•细胞培养•开始：1907，Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元•成熟：以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系。•研究内容：细胞内代谢活动，外界对其影响，细胞间互相作用等。历史细胞融合现象的发现19世纪30年代，Muller等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象；1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在；1855年～1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞；1859年，A.Barli在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。至此，自然界中广泛存在着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。动物细胞培养技术的建立1907年，Harrison首先培养了蛙胚神经管区细胞，并观察到从中长出的轴突细胞（神经纤维），他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志；1911年，Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。1914年，Thomson建立了器官培养技术。1940年，1951年，Earle和Gay分别建立了c3H小鼠结缔组织细胞系的L系和人体细胞系－人体宫颈癌Hela细胞系。A.Carrel细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生1958年,Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。60年代，Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型，利用HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。动物克隆技术的建立首例克隆动物成功的报道是在1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1％的重组卵发育成为成熟蛙。这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：实验证明了完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的mRNA与有关的蛋白质。动物细胞培养的优点•⑴理化环境可控制。•⑵细胞经培养后形成的细胞系和细胞株，特征均一。•⑶培养物可直接被观测。•⑷提供大量均一的细胞供制备用。•⑸便于进行人工筛选。•⑹结合电影技术，可观察细胞代谢活动和反应。•广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，分化及发育，细胞毒理试验，生物技术等各个领域。3.11培养细胞的特性根据形态特征分类贴壁型上皮细胞型、成纤维细胞型、游走细胞型、多形细胞形。悬浮型悬浮在溶液中两种贴壁的培养细胞细胞贴壁过程接触抑制定义：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。培养细胞一代生长过程1）游离期2）指数生长期3）稳定期4）衰退期培养细胞的生存环境1.环境无毒和无菌；2.适宜的温度；人和哺乳动物培养细胞最适温度均为35－37℃。3.气体环境和氢离子浓度；需要一定量的O2（1995－9975pa）和CO2（95％空气+5%CO2）；pH7.2-7.44.渗透压；260－320mOsm/kg适用于大多数细胞5.营养物质；六碳糖是主要的能源物质，还需要12种基本氨基酸和谷胺酰胺等培养群体细胞的生命期贴壁细胞原代培养定义：从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养，一般持续1－4周。将分离所得的细胞沉淀，按实验要求，用培养液配制成需要浓度的细胞悬液，接种培养瓶内，水平放置，37度，进行培养，1—2天换液一次，大部可见细胞贴壁生长。贴壁细胞传代培养定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。注意：①如细胞没有生长到足以覆盖瓶底时，一般不要传代。②原代细胞类型不一，利用不同的消化时间和消化液。细胞系（株）的建立细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。转化时间和细胞类型与培养条件和培养方法有关CO2培养箱纯化水装置金属器材辅助器材加样器支架离心管冷冻管清洗和消毒过程过滤除菌消毒•血清、合成培养液、酶液等含有蛋白质，具有生物活性，不能采用高温、高压消毒的方法进行灭菌，因此须采用过滤除菌•①Zeiss滤器：中间夹石棉的一次性纤维滤板，可承受一定压力，是过滤血清等粘稠液体的滤器。•②玻璃滤器：以烧结玻璃为滤板，固定在一玻璃漏斗上，用于过滤除血清等粘稠液体以外的各种培养液体•③微孔滤膜滤器：中为混合纤维素滤膜，又可分为加压式和抽滤式。过滤器3.12培养液的组成成分•氨基酸：十二种氨基酸必需，谷氨酰铵，谷氨酸等•盐类：钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，氯离子，硫酸根离子，磷酸根离子，碳酸氢根离子等•葡萄糖：供能•缓冲系统：CO2缓冲系统或HEPES•生长因子：PDGF，EGF，FGF等•其它成分：维生素，矿物，有机补充物，激素等平衡盐溶液（BSS）•功效：①维持渗透压②提供缓冲系统③提供水分和无机盐•要求：①和培养物来源的动物血清相似②等渗天然培养基•血清：提供营养和生长因子，促进细胞生长繁殖，粘附及中和有毒物质•血浆：支持培养组织块及供给细胞生长的营养物质，现在不常用•组织浸出液：可用鸡胚胎浸出液，含大分子核蛋白质和小分子氨基酸，能促进细胞生长•水解乳蛋白：氨基酸含量高，由乳白蛋白质经水解得到淡黄色粉末，一般可配制成0.5%溶液。人工合成培养基•人工合成培养基：化学成分明确的培养基，便于重复和标准化管理和控制。•基本成分：氨基酸，维生素，糖，无机离子等•常用培养液：199培养液，Eagle培养液，RPMI1640培养液等三种常用培养基配方其它常用液消化液：胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二钠（EDTA）及胶原酶溶液HEPES氢离子缓冲剂：调节pH值NaHCO3溶液：调节pH值NaHCO3+H2O→Na++HCO3+H2O→Na＋＋H2CO3＋OH-→Na++OH-+H2O+CO2↑抗生素液：防止污染台盼蓝注意•每一个细胞系都要进行大量，费力，费时的工作后，才能找到适当的培养液配方，对正常细胞，转化细胞，原代培养，建株培养，悬液培养等所选用的培养液、培养方法可能不同。•在开始培养细胞前，应查找有关文献。3.2动物组织培养技术防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！1）培养前准备：制定实验计划和操作程序。2）超净台要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。3）个人进入无菌培养室原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁而灭消毒手和前臂。4）实验中需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。5）分别使用不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用6）不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。7）注意操作时勿大声讲话或咳嗽。取材1)理论上讲，各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养。2）幼体较成体、分化程度低的较分化程度高的、肿瘤组织较正常组织容易培养3）组织取材应先切成1cm3的小块，可置于培养液中4度保存，不易超过24小时。4）取材时避免污染及化学物质的损伤。皮肤取材1）皮肤细胞培养的来源2）方法类似断层皮片手术的操作，面积为2－3mm23）不用碘酒消毒，但要严格灭菌消毒，必要时使用抗菌素。血细胞取材1）静脉取血2）指尖或耳垂取血3）用肝素抗凝剂20u/ml4）抽血严格无菌取鼠胚1）用引颈法杀死动物2）浸入75％酒精中5分钟消毒3）开腹取材取鸡胚1）选新鲜受精鸡蛋，37度孵育9－12天，每天翻动鸡蛋一次。2）无菌条件下，将鸡卵置于一个小烧杯中，令气室端向上，用碘酒消毒卵壳，再用酒精消毒。3）用弯剪刀环行剪除气室端卵壳，切开卵膜，暴露出鸡胚。4）用弯头钝玻璃棒伸入鸡胚头体之间下方，取出鸡胚。组织块分离切割分离组织法用剪刀剪至1mm3左右的大小的块。机械解离分离法某些软组织如脑、胚胎和一些肿瘤等消化分解法胰蛋白酶法适用消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等钙离子、镁离子、血清等都对其有抑制作用。胶原酶解细胞法结缔组织复合胶原，用胶原酶解，使胶原酶最终浓度为200u/ml，36.5℃，静置4—48小时，上面悬液经离心获得或纤维细胞沉淀。EDTA法二乙烯四乙酸二钠，非酶性消化物用于消化分离传代细胞，能螯合钙离子，镁离子，EDTA工作液用不含钙离子和镁离子的BSS配制成0.02%的浓度通常和0.25％的胰蛋白酶1：1合用细胞悬液的分离方法材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可以采用离心法分离细胞。一般多用500－1000rmp，5－10分钟。培养细胞的纯化自然纯化：靠自然的增殖能力，留下优势细胞，去除其他，达到纯化目的，如恶性肿瘤细胞酶消化法：上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞会先被消化机械划除法：用机械外力划除混杂分区呈片的不需要细胞反复贴壁法：根据不同细胞贴壁的速度不同。克隆法，培养基限定法，流式细胞分离法等3.21采用的一些培养方法悬滴培养法培养瓶培养法旋转管培养法灌注小室培养法悬浮培养法载体和生物反应器1、悬滴培养法单盖玻片悬滴培养法•①将培养液滴于盖玻片上并铺展开•②将待培养的组织块铺展于培养液中央•③将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封•④贴壁24小时内，细胞就能从组织块四周游走•适用于组织量少的原代培养单盖玻片的再培养1）用消毒剃须刀刮去盖玻片四周的石蜡2）用镊子小心揭开盖玻片，培养物面朝上，放入培养皿内。3）用白内障刀切除生长晕周围部分，留下方形培养物，并切成小块。4）将小块在含有平衡盐溶液的培养皿中再漂洗，移入另一含有平衡盐溶液的培养皿内，进行再培养。双盖玻片悬滴培养法方法和前面基本相同。不同点：取一载体盖玻片，在其上滴一滴大小适当的消毒蒸馏水。将带有组织块的盖玻片的无组织一面贴到载体盖玻片上，借助水滴的扩展，将两张盖玻片贴牢在一起。培养两天后，将带有培养物的盖玻片取下，漂洗后将其贴于一张新的载体盖玻片上，继续培养。优点：1）容易换片。2）培养物在培养过程中，不需移动位置，有利于组织分化。2.培养瓶原代培养•器材：培养瓶•材料：组织块或单层细胞•方法：单层细胞用消化培养法，将组织消化成为细胞悬液后培养•组织块以间距0.5cm均匀摆置在瓶壁上，翻转瓶，注入适宜培养液，37℃恒温2—4小时，待贴附后，再翻转平放，静置培养。培养瓶传代培养3.旋转管培养法•器材：旋转管，旋转瓶•由于旋转作用，组织块和细胞交替地与培养基和空气直接接触。4.灌注小室培养法