从改善睡眠作用研究四逆散的疏肝解郁功效

〔WorldScienceandTechnology/ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica〕1367四逆散源自汉代张仲景的《伤寒论》，由甘草、枳实、柴胡和芍药组成，具有透邪解郁、疏肝理气的功效，主治阳郁厥逆或肝脾不和证[1]。现代药理学研究表明，四逆散具有保肝、抗动脉硬化、增强胃肠推进功能、增强免疫功能、抗休克、解痉和改善微循环等作用[2]。本研究团队依据临床研究文献“肝气郁滞/肝脾不和证型在失眠辨证中为常见证候和运用四逆散/四逆散加减治疗失眠”相关的报道[3-5]，自1999年开始，在国家自然科学基金等科研项目的资助下，历经15年的时间，开展了四逆散改善睡眠作用的系统药理评价研究，探讨四逆散疏肝解郁功效与改善睡眠作用之间的关系，为中药复方功效的研究提供参考。1 四逆散改善睡眠作用的研究目前，从药理学角度来评价药物是否具有镇静催眠/改善睡眠的作用，主要采取的是行为学或电生理学等实验研究方法，尤其以行为学研究的方法更为常用。但是，随着睡眠神经生物学机制研究的深入与现代技术的发展，电生理学、生物化学、细胞生物学、分子生物学等研究方法与技术逐步被应用于评价药物是否具有镇静催眠/改善睡眠的作用研究。在评价药物是否具有镇静催眠/改善睡眠作用的研究中，应用的模式生物从小鼠、大鼠等扩展到果蝇等其他种属的动物。这些均为评价药物是否具有镇静催眠/改善睡眠作用提供了更为丰富的方法与技术。1.1基于大鼠/小鼠模式生物的四逆散改善睡眠作用的研究四逆散可以明显延长阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间[6]。在一定剂量范围内，随着剂量增加，四逆散改善睡眠的作用随之增加，两者之间呈现线性关系，最佳有效剂量为1250mg·kg-1。随着给药时间的增加，四逆散冻干粉改善睡眠的作用逐渐增强，起效天数为7天，第9天作用效果最大。正常大鼠的皮层脑电描记与分析结果表明，四逆散水煎液可明显减少大鼠觉醒时间，延长总睡眠时间（TotalSleepTime，TST）、慢波睡眠的深睡眠2015-04-022015-06-023067263481073077从改善睡眠作用研究四逆散的疏肝解郁功效＊（黑龙江中医药大学药学院哈尔滨150040）摘 要关键词doi10.11842/wst.2015.07.007R277.7A2015Vol.17No.7〔WorldScienceandTechnology/ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica〕1368（SlowWaveSleep，SWS2）时间和快速眼球运动睡眠（RapidEyeMovementSleep，REMS）时间。睡眠剥夺大鼠的皮层脑电描记与分析结果表明，四逆散可明显减少大鼠的觉醒时间，延长大鼠的TST，主要表现为延长SWS2和REMS，可使SWS2延长至接近正常，对SWS1没有明显作用[7]。1.2基于果蝇模式生物的四逆散改善睡眠作用研究[8]果蝇睡眠实验结果表明，四逆散冻干粉改善睡眠作用的量效关系因果蝇的性别不同而有所差别。对于雌果蝇，与空白对照组比较，当四逆散冻干粉的浓度达2%时，睡眠时间延长；达到4%时，睡眠时间明显增加。对于雄果蝇，在四逆散冻干粉的浓度小于2％的范围内，随着剂量的增加，药效增加，但大于2％后药效不再增加。四逆散冻干粉改善果蝇睡眠作用的时效关系研究结果表明，雌果蝇随给药时间增加，睡眠时间逐渐延长，连续给药4天药效最强；雄果蝇随给药时间增加，睡眠时间逐渐延长，连续给药7天药效最强。光剥夺果蝇睡眠的实验结果表明，无论雌性还是雄性果蝇，与空白组相比，睡眠剥夺对照组果蝇睡眠时间明显减少；与睡眠剥夺对照组相比，四逆散冻干粉给药组果蝇睡眠时间明显延长，具有显著性差异。机械剥夺果蝇睡眠的实验结果表明，无论雌性还是雄性果蝇，与空白组相比，睡眠剥夺对照组果蝇睡眠时间明显减少；与睡眠剥夺对照组相比，四逆散冻干粉给药组果蝇睡眠时间明显延长，具有显著性差异。2 四逆散改善睡眠作用机制的研究目前为止，睡眠的生物学机制尚未完全阐明。近几十年来，随着脑科学/神经生物学的发展，睡眠的生物学机制研究获得了显著的研究成果。基于研究成果建立了“睡眠-觉醒的触发开关”学说，对哺乳动物睡眠-觉醒相关现象进行了强有力地解释，并得到了人们的认同。该学说认为，在昼夜节律/体内生物钟或体内睡眠促进因子的作用下，睡眠中枢-下丘脑视前区腹外侧部（VentrolateralPreoptic，VLPO）神经元细胞被激活，释放γ氨基丁酸（GammaAminoAcidButyricAcid，GABA）神经递质，从而抑制维持觉醒的网状上行激活系统而使哺乳动物进入睡眠状态。反之，在相关促觉醒因素的作用下，网状上行激活系统被激活，同时抑制下丘脑VLPO神经元细胞而使哺乳动物进入觉醒状态[9]。2.1基于GABA能神经系统介导的四逆散冻干粉改善睡眠作用的机制研究[10]苯二氮卓类受体阻断剂-氟马西尼可以明显阻断地西泮（2.5mg·kg-1，i.g.）和四逆散冻干粉（1250mg·kg-1，9天，i.g.）对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的增强作用。在此基础上，采用RT-PCR技术，观察了四逆散冻干粉对GABAA受体al和a5亚单位的mRNA表达影响。实验结果显示，四逆散冻干粉（1250mg·kg-1，9天，i.g.）可以明显上调小鼠大脑皮质GABAA受体al亚单位和a5亚单位的mRNA表达，其作用与地西泮（2.5mg·kg-1，i.g.）相似，但四逆散冻干粉侧重于上调a5亚单位，而地西泮侧重于上调a1亚单位。2.2基于NO信号通路介导的四逆散冻干粉改善睡眠作用的机制研究[11]四逆散冻干粉（1250mg·kg-1，9天，i.g.）能明显升高小鼠全脑内NO含量，提高总一氧化氮合酶（TotalNitricOxideSynthase，TNOS）活力。阈下剂量的四逆散冻干粉（312.5mg·kg-1，9天，i.g.）合并NO前体物质L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg，125mg·kg-1，i.p.）应用后，能明显延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间，表现一定的协同作用。阈剂量的四逆散（1250mg·kg-1，9天，i.g.）合并L-Arg（500mg·kg-1，i.p.）应用后，能明显缩短戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间。给予拮抗剂L-NAME（80mg·kg-1，i.p.）可明显拮抗四逆散的催眠作用。综上表明，四逆散改善睡眠的作用是通过适当增加NO含量而起效的。2.3基于5-HT能神经系统介导的四逆散冻干粉改善睡眠作用的机制研究[12]阈下剂量的四逆散（312.5mg·kg-1，9天）合并5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）前体物质5-羟色氨酸（5-Hydroxytryptophane，5-HTP）（25mg·kg-1，i.p.）应用后，能明显延长戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠时间，表现一定的协同作用。皮下注射对氯苯丙氨酸（Para-Chlorophenylalanine，PCPA），可以明显缩短戊巴比妥钠所致小鼠的睡眠持续时间，对这种PCPA化小鼠，阈剂量四逆散具有明显拮抗作用，四逆散延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间的作用可被PCPA（300mg·kg-1，s.c.）化阻〔WorldScienceandTechnology/ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica〕1369断。以上研究结果说明，四逆散改善睡眠作用主要依赖于5-HT的存在。四逆散合并5-HT1A受体拮抗剂p-MPPI或5-HT2受体拮抗剂利坦色林（Ritanserin）给予实验小鼠，p-MPPI（0.05mg·kg-1，i.p.）可以明显拮抗四逆散（1250mg·kg-1，9天，i.g.）对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间的延长作用，合并Ritanserin（8mg·kg-1，i.p.）与单独给予四逆散冻干粉（1250mg·kg-1，9天，i.g.）没有显著性差异。以上研究结果说明，四逆散延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间与5-HT2受体无关，与5-HT1A受体有关。采用在体脑微透析及同步记录大鼠脑电图/肌电图（Electroencephalo-Graph/Electromyography，EEG/EMG）技术，观察了四逆散冻干粉（1250mg·kg-1，9天，i.g.）对自由活动大鼠觉醒期和慢波睡眠期脑中缝核5-羟基吲哚乙酸（5-HydroxyIndoleAceticAcid，5-HIAA）释放量的影响。结果表明，灌胃给予四逆散冻干粉后，能明显降低觉醒期和慢波睡眠期自由活动大鼠中缝核内5-HIAA的含量。2.4基于SP介导的四逆散冻干粉改善睡眠作用的机制研究采用酶联免疫法，观察了四逆散对小鼠全脑SP含量的影响。实验结果表明，四逆散冻干粉（1250mg·kg-1，9天，i.g.）能明显降低小鼠全脑SP含量。2.5基于细胞因子介导的四逆散冻干粉改善睡眠作用的机制研究采用酶联免疫法，观察了四逆散对小鼠全脑白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）含量的影响。实验结果表明，四逆散冻干粉（1250mg·kg-1，9天，i.g.）能明显降低小鼠全脑的IL-1β和TNF-α含量。3 四逆散改善睡眠作用药效物质基础的研究[13-20]在利用高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）建立四逆散中4味药材主要化学成分（芍药苷、柚皮苷、柴胡皂苷A、甘草次酸）的含量测定方法与四逆散冻干粉的制备工艺及质量控制标准研究的基础之上，建立了四逆散冻干粉的HPLC指纹图谱，然后在相同色谱条件下，进行了四逆散冻干粉血清中移行成分及脑脊液中移行成分分析。四逆散冻干粉血清移行成分分析结果表明，血清中共有14个移行成分。血中移行成分来源认定的结果显示，1号成分属枳实及四逆散冻干粉中可直接入血成分；2号成分为辛弗林；3号成分属甘草及四逆散冻干粉中可直接入血成分；4号成分为芍药苷；5号成分是入血后产生的新化合物，是四逆散、各单味药及拆方后均没有的成分；6号成分属甘草及四逆散冻干粉中可直接入血成分；7号成分属枳实及四逆散冻干粉中可直接入血成分；8号成分为白芍的体内代谢转化物；9号成分为甘草的体内代谢转化物；10号成分为枳实的体内代谢转化物；11号成分属甘草及四逆散冻干粉中可直接入血成分；12号成分为柴胡皂苷C；13号成分为枳实与其它药物配伍经体内代谢所产生的新物质，在柴胡、白芍、枳实、甘草各单味药冻干粉及其血清指纹图谱中均不存在，说明该成分不是各单味药的体内代谢产物或直接入血成分，在四逆散去掉枳实后，13号成分消失，说明该成分是枳实与其它药物配伍后在体内产生的，在四逆散分别去掉柴胡、白芍、甘草后13号成分仍存在，只是峰面积积分值减小，说明对于13号成分的产生，各药均有一定贡献，其中枳实对该峰的出现起到决定作用；14号成分为甘草次酸。四逆散冻干粉脑脊液中移行成分分析结果表明，脑脊液中除戊巴比妥钠成分外，并无四逆散冻干粉的血中移行成分进入。但是，大鼠脑脊液中的某一内源性物质明显增多。依据上述研究结果，经认真地对四逆散冻干粉的血清中移行成分分析发现，组成四逆散的枳实中的辛弗林、白芍中的芍药苷、柴胡中的柴胡皂苷C和甘草中的甘草次酸均可直接入血，而且峰面积相对其它血清中的移行成分而言均较大。基于药量与其活性相关的一般规律，本研究初步认定了四逆散冻干粉改善睡眠作用的药效物质基础是血清中四逆散的移行成分辛弗林、芍药苷、柴胡皂苷C和甘草次酸。随后，本课题组开展了相关的药效学验证性研究，实验结果也支持该研判。4 四逆散改善睡眠作用药理评价的反思与启示4.1镇静催眠与改善睡眠作用在《药理实验方法学》中明确阐述：“催眠作用是指药物引起深度的中枢抑制，失去清醒并伴有肌张力和翻正反射消失”[21]。当