详解Trizol提取RNA原理、步骤和注意事项

详解Trizol提取RNA原理、步骤和注意事项Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。（一）试剂准备1．Trizol试剂。2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（DEPC水配制）5．DEPC水细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质，再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。（二）操作步骤1．样品处理：（1）细胞：1）悬浮细胞：移入1.5ml离心管中，1200转，离心5min，弃上清，PBS洗，重复两次，最后弃ＰＢＳ，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。２）贴壁细胞：PBS洗两次，最后弃ＰＢＳ，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。（2）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置15min。3．4℃离心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。6．加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，8000g×5min，弃上清。7.晾干，加入适量的DEP水溶解（65℃促溶10-15min）。（三）注意事项1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。（四）总RNA定量RNA定量方法与DNA定量相似，RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。