免疫层析标记物及其标记技术

免疫层析标记物及其标记技术定量技术部：张赛免疫层析技术概况1免疫层析标记物2免疫层析标记技术34胶乳标记过程中常见问题免疫层析技术概况免疫层析技术概况免疫层析测定法（ImmunochromtogaphicAssay，简称ICA）是出现于20世纪80年代初期，将免疫标记技术与层析技术结合的一种新型检测技术。待测物层析方向免疫反应TC免疫层析技术基本原理示意图免疫层析技术概况新型免疫层析技术上转磷光标记免疫层析量子点标记免疫层析纳米磁珠标记免疫层析时间分辨荧光免疫层析荧光胶乳标记免疫层析胶体金免疫层析技术标记物稳定性差，结果靠肉眼观测，检测灵敏度低，只能用于定性或半定量检测。免疫层析标记物胶体金胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如柠檬酸钠、白磷、抗坏血酸、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗粒表面的过程。由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态。作用力静电作用力疏水作用力配位键结合力富含赖氨酸、精氨酸非极性氨基酸（色氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸）含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）胶体金胶体金免疫层析技术优点几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单，效率高，用量少，基本不改变被标记蛋白的活性。检测结果直接用颜色显示，肉眼判断容易，不需要特别仪器设备，操作简便。胶体金免疫层析技术不足采用物理吸附的方法结合，抗原/抗体容易从金纳米颗粒表面脱落下来，标记物不稳定。只能给出定性或半定量的结果，由于仪器的限制，目前还未能准确的定量。荧光胶乳荧光胶乳是指将荧光染料通过物理吸附法、自组装法、化学键合法、共聚法、包埋法等方法吸附或包埋到粒子内而形成的直径在纳米至微米级（0.01~10μm）范围内，受激发光源激发能发出荧光的固体微粒。原胶乳免疫胶乳荧光胶乳荧光胶乳颗粒粒度均一、单分散性好，有较好的生物相容性；形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定。荧光乳胶层析法比一般的胶体金等固相免疫灵敏10～100倍，可以有效排除背景色的干扰，且能够对待测物进行定量测定。荧光胶乳颗粒的缺点是荧光染料系物理掺杂，容易发生泄漏，同时高分子胶乳颗粒的表面修饰不够灵活，且由于多数具有输水性质，而易发生非特异性吸附。上转磷光颗粒上转磷光材料(up-convertingphosphor，UCP)是新近发展起来的由2种稀土金属元素（分别作为光吸收子和发射子）掺杂于氧化硫等惰性材料中构成的一类能上转发光产生磷光的纳米级示踪材料。上转磷光颗粒天然生物材料不具备上转发光的特性，其发光信号不受检测环境的影响，故样品本底低而灵敏度高，非常适合定量检测。与易淬灭的荧光素标记物不同，UCP不存在光学衰减且化学惰性强，不受样品腐蚀或标记物自身衰变等影响，具有稳定的发光特性，可长期存放和重复检测。军事医学科学院微生物流行病研究所、北京热景生物技术公司，已经在UPT技术平台上研制成功多项快速定量检测试剂并产业化。时间分辨荧光纳米粒子时间分辨荧光免疫分析法是用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素铕(Eu3+)、铽(Te3+)及钐(Sm3+)、镝(De3+)等螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。时间分辨荧光纳米粒子荧光激发光波长范围较宽，发射光谱峰范围窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移，有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的准确性。标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。量子点量子点（quantumdots,QDs）又称荧光半导体纳米颗粒，用于生物探针的量子点主要由第二副族和第六主族的元素组成，如硒化镉（CdSe）、硫化锌（ZnS）、碲化镉（CdTe）、硫化镉（CdS）等。粒径多介于1~10nm，极小的粒径，外观似点状，故得名为量子点。量子点QDs的发射光谱可以通过改变QDs的尺寸大小来控制，用单一波长的光即可激发产生多种不同颜色的荧光，被认为是最适合作为多标记检测的标记物；QDs激发谱宽而发射谱窄，并且具有较大的Stokes位移，都在很大程度上提高检测的准确性；QDs荧光寿命长，即不易衰变，稳定性高，可重复检测。QDs在制备、修饰及抗原抗体标记等环节受到技术要求制约，结合物稳定性也有待提高，并且检测时需紫外光作为激发光，仪器设备要求和成本都较高。免疫磁珠免疫磁珠（immunomagneticbeads，IMB）是包被有单克隆抗体的磁性微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性结合形成复合物，是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。磁性免疫层析技术利用超顺磁性纳米微粒作为标记物，由高灵敏度磁性检测仪测量包被了免疫复合物的磁性微粒所产生的局部磁场效应，而得出待测分析物的定量结果。免疫磁珠免疫层析标记技术免疫层析标记技术胶体金标记技术蛋白质的预处理：•蛋白质应先对低离子强度的水透析，去除盐类成份。盐类成份能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉；•用微孔滤膜或超速离心除去蛋白质溶液中的细小微粒。蛋白与胶体金结合最佳pH确定•0.1mol/LK2CO3调pH，原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略偏碱。胶体金与蛋白质的结合•确定所用蛋白比例（一般15~20ug/mL胶体金），加入BSA，PEG等稳定剂。免疫胶体金的纯化•超速离心，复溶液保存。胶乳标记技术采用羧基化（COOH）的荧光微球，微球大小在200~500nm（F4、F1、F2)。其标记的大致流程如下：•将荧光微球进行清洗，并更换为标记所需缓冲液；•加入EDC和Sulfo-NHS进行活化；•加入待标记蛋白经行交联；•封闭未反应的微球活性表面；•采用适当的保存液保存。胶乳标记技术EDC/NHS活化反应原理胶乳标记技术荧光胶乳标记过程的优化活化缓冲液种类、离子强度、pHMES、醋酸盐缓冲液、PBS、硼酸盐缓冲液等EDC及Sulfo-NHS用量及活化时间EDC-20℃保存，易潮解，称量快速，NHS4℃保存，现用现配蛋白标记浓度及反应时间封闭剂种类、浓度及封闭时间乙醇胺、BSA、酪蛋白、非离子型表面活性剂、“Irrelevant”IgG、明胶、PEG标记保存液胶乳标记过程中常见问题胶乳标记过程中常见问题1、问：如何选择胶乳微球的粒径？答：一般选择粒径小的胶乳微球，则需要的抗体量就多，精密度和线性相对较好，而选择粒径大的胶乳微球性，则所需抗体少，精密度和线性相对较差，相对于小球，大球的灵敏度较好。2、问：蛋白（抗体）与微球偶联前，是不是微球的活化时间越长，效率越好？答：羧基微球的活化所需时间很短，一般以10-20分钟为宜，长时间的活化反而会降低偶联效率。胶乳标记过程中常见问题3、问：胶乳微球与抗体偶联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集，这是什么原因？如何控制和避免？答：偶联效率低，当体系中蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，所以有聚集。可以加一些阻断剂BSA，另外，也可提高微球的交联率。但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定，只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。胶乳标记过程中常见问题4、问：由于抗体不只是FC的氨基酸上有NH2，是不是表示它可以在任何方向与EDCA活化微球偶联呢？如果是这样，是不是会影响抗体与抗原的特异性反应？答：由于抗体的空间折叠方式和FC端疏水性强，因此偶联反应的绝大多数发生在Fc端，对抗体与抗原的结合的影响不大。5、问：在使用离心方法偶联乳胶微球，一般需要多大的（相对）离心力？答：需要多大的离心力和离心时间跟所使用的乳胶微球粒径有关，13000r/min时F2需要15min，F1需要20min，F4需要25min，粒径越小所需时间越长，离心力越大。