SMARTer技术介绍

June9,2021SMARTerTMRACE技术介绍南宁科迪生物技术有限公司•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍2•主要内容June9,202121SMARTerTM技术2SMARTerTMRACE3实验操作介绍•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍3•June9,202131SMARTerTM技术一步RT，一步PCR轻松获得全长双链cDNA•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍4••DNApolextends3’ends,displacingnextRNApieceAAAAA5’3’(start)(stop)mRNAtranscript(polyA+RNA)AAAAA5’3’TTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTT3’5’AAAAATTTTToligoprimer5’3’•PrimemRNAwitholigoprimer•RTextendsprimerRNaseHDNApolDNALigaseSecondStrandEnzymeCocktail•RNaseHcreatesnicksinRNA•Ligaseligatessegments•“GublerandHoffmanprocedure”(Gubler,U.&Hoffman,B.J.(1983)Gene25:263-269)传统cDNA合成技术June9,20214•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍5•June9,20215AAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGGRT反应SMARTer双链cDNA合成原理示意图•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍6•SMARTTM技术SMARTTemplateRNASwitchingMechanismAttheendofJune9,20216末端转移酶活性自动转换模板功能SMARTScribeTM反转录酶•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍7•XXXXX第一链cDNA各种应用RACEPCR,qPCR文库构建消减杂交新一代测序探针制备正义RNA扩增PCR扩增dscDNAJune9,20217•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍8•June9,20218SMARTer使您更轻松的获得5’端GettingSMARTer•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍9•June9,202192SMARTerTMRACE•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍10•SMARTTM技术SMARTTemplateRNASwitchingMechanismAttheendofJune9,202110末端转移酶活性自动转换模板功能SMARTScribeTM反转录酶•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍11•SMARTerTM技术概要•获得更长的第一链cDNA•灵敏性更高•提高PCR产物的产量升级版SMARTerIIAoligo•可进行polyA—RNA的5’RACE实验SMARTerRACEKits包含随机引物June9,202111•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍12•图1.SMARTScribeTMRT获得更长的第一链cDNA。polyA+RNA为模板。SMARTScribeTMRT—合成更长的第一链cDNAJune9,202112•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍13•SMARTScribeTMRT—获得最长14.6kb的片段June9,202113•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍14•图2.利用SMARTScribeRT和合成的RNA为模板进行RT-PCR分析。合成的RNA模板进行一系列的梯度稀释后，样品中含有105-10RNA的拷贝。在的RNA模板中添加50ng的HeLa细胞总RNA，以增加模板的复杂度。使用Advantage®2DNAPolymeraseMix合成第二链。36个循环后获得350bp片段。SMARTScribeTMRT—灵敏度高LaneM:100bpDNAsizemarker.SMARTScribeRT可以从低至10个RNA拷贝中合成第一链cDNA。June9,202114•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍15•June9,2021TitleofthePresentationcangohere15SMARTerRACE1.步骤简单（就是RT+PCR）。2.不用纯化核酸，降低降解几率，获得更长序列3.起始模板量小，50ngtotalRNA即可，低至10ng。也无需用DNase来处理RNA。4.抑制性PCR设计，有效抑制非特异性扩增及单引物扩增。5.应用SMART技术，发高因子paper。6.5’RACE、3’RACE都能做。富集5’端，产物更好分析。7.可以对无polyA尾的样品进行RACE。SMARTerTM技术优势•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍16•June9,2021163Clontech试剂盒•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍17•SMARTerTM技术相关产品SMARTerTMRACE合成更长cDNA合成芯片用荧光探针新一代测序线性扩增mRNA构建cDNA文库June9,202117•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍18•SMARTerRACE试剂盒SMARTerRACE最终结果是获得5’端和3’端序列•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍19•June9,202119HumangeneSizeofmRNA(kb)+(bp)*MatchesgenomicsequencesIncludesTranscriptionstartsiteTransferrinreceptor5.0+25yesyesSmoothmuscleg-actin1.28+31yesyesVascularsmoothmuscleα-actin1.33+17yesyesCytoskeletalγ-actin1.9+1yesyes23kDaHBP0.67+9yesyesp532.6+4yesyesInterferon-γreceptor2.06+14yesyes14-3-3protein1.03+1n/an/aInterferon-αreceptor2.75+17yesyesSMARTer™RACE获得更长的5’末端n/a=notavailable*ComparedtoGenBankcDNAsequence.•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍20•June9,202120PolyA+或TotalRNA(10ng-1µg)SMARTerTM合成一链cDNA标准方法合成一链cDNA5’RACE片段3’RACE片段5’RACE-ReadycDNA3’RACE-ReadycDNARACE产物克隆、测序5’RACEPCR3’RACEPCR全长cDNASMARTerTMRACE实验流程4-6小时•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍21•LongerUPMShortUPMNUPSMARTIIAOligoSMARTerTMRACE独特的引物设计•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍22•GGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAALongUPMCCCSMARTIIAoligoCCCCCCSMARTIIAoligo抑制性PCR的设计使末端带有同样序列的分子形成锅饼结构有效的抑制错配产物和单引物产物的扩增抑制性PCR设计ShortUPMNUP低背景•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍23••实验来源：SMARTerRACEkit的control实验–实验材料：HumanPlacentalTotalRNA–实验目的：transferrinreceptor(TFR)基因的5’RACE和3’RACE获取–实验方法：SMARTerRACESMARTer™RACE实验例•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍24••实验步骤1：•TotalRNA提取：•我们建议使用TakaraRNAisoplus提取，获得产物需要进行电泳检测。•在普通琼脂糖凝胶电泳中，如右图，totalRNA在1.8k,1k附近有明显的两个条带，比例为1-2：1。在甲醛变性胶上，哺乳动物的totalRNA应该是在4.5kb，1.9kb上有明显的两条带。这两条带的亮度比应该在1-2：1。•纯化的polyARNA应该是在0.5-12kb的smear，片段分布会小于非哺乳动物。普通1.5%的琼脂糖Lane1：DL-2000Lane2：totalRNAMRNA2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpSMARTer™RACE实验例•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍25••实验步骤2：•5’RACE一链合成•5’RACEreadycDNA的制备：•要点：–反转录引物选择5’-CDSprimerA和SMARTIIAoligo–TotalRNA使用量最佳为1ug–推荐42度孵育1.5小时时，用热盖PCR仪来操作。–稀释的样品-20度最多保存三个月实验步骤2：3’RACE一链合成3’RACEreadycDNA的制备：要点：–反转录引物选择3’-CDSprimerA–TotalRNA使用量最佳为1ug–推荐42度孵育1.5小时时，用热盖PCR仪来操作。–稀释的样品-20度最多保存三个月SMARTer™RACE实验例•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍26••实验步骤3：•RACE•要点：–用稀释的cDNA作为样品–PCR酶的选择，建议使用advantage2PCRkit。–如果要高保真，选择HFkit；–如果高GC选择GCkit。–但是扩增长度最好选择在4kb以内，尤其在选择HFkit的时候。–选择TouchDownPCR方案SMARTer™RACE实验例•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍27••实验结果分析•Control结果：•5’RACE：2.6kb•3’RACE：2.9kb•如果条带不清楚，加大循环数。Control可以在42cycle或者更少的cycle数获得比较清晰的目标条带。Lanes2&5:transferrinreceptor（control）Lanes1&4:interferon-γreceptorLanes3&6:HPRTSMARTer™RACE实验例•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍28••NestedPCR的问题–一般不需要做NestedPCR–当第一次PCR增加循环数后产物仍然没有专一的条带或者是smear条带，建议使用NestedPCR。–第一次PCR的产物需要稀释（50倍）后作为模板再进行NestedPCR•产物分析：–1.比较GSP产物和NGSP产物–2.克隆，测序。SMARTer™RACE实验例•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍29•去帽法缺点：1.RNA需要做两步处理，有两步纯化，易降解，操作难度大2.起始模板量大，需要1-2ugtotalRNA3.后期PCR操作，应用的是套式PCR，产物分析难度大4.容易获得非全长片段去帽法SMARTerRACE对比1Takara5’RACERACEKitPK1•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍30•Step1.一链合成Step2.纯化cDNAStep3.Tdt加C尾反应Step4.RACEPCRStep5.NestedPCRStep1.一链合成Step2.RACEPCRStep3.NestedPCRSuperScriptIISMARTScribeInvitrogen5’RACESMARTerRACE对比2InvitrogenSMARTerRACERACEKitPK2步骤简单•SMARTerTM(SMARTTM)技术介绍31••1.GSP引物设计原则：•23–28nt