分子生物学技术原理

常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication分子杂交技术电泳PCR技术DNA测序DNA芯片技术COPYRIGHTJISHUYU电泳第一节一.电泳的基本原理电泳——带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（X）的乘积。F＝QX质点的前移同样要受到阻力（f）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f＝6πrην（r为质点半径，η为介质粘滞系数，ν为质点移动速度）当质点在电场中作稳定运动时：F＝f即：QX＝6πrην迁移率u：单位电场强度下的电泳速度，粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和形状。u＝v/E=q/6πrηv=QX/6πrη二.影响因素1.待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。2.缓冲液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持pH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02-0.2之间。3.电场强度：过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。4.电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。5.支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大三.分类按支持介质的不同可分为：⑴纸电泳(Paperelectrophorisis)⑵醋酸纤维薄膜电泳(CelluloseAcetateelectrophoresis)⑶琼脂凝胶电泳(AgarGelelectrophoresis)⑷聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegelelectrophoresis)⑸SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)按支持介质形状不同可分为：⑴薄层电泳；⑵板电泳；⑶柱电泳三.分类按待分离大分子的不同可分为：DNA电泳RNA电泳蛋白电泳其他双向电泳测序电泳脉冲场电泳核酸电泳原理核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidiumbromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。核酸电泳介质琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围核酸电泳缓冲液TBEBuffer(pH8.3)10×1×Tris-硼酸850mM85mMEDTA20mM2mMTAEBuffer(pH8.5)50×1×Tris-醋酸2M40mMEDTA100mM2mM相关试剂溴化乙啶浓度10mg/ml（2万倍）（工作浓度为0.5mg/ml）6×LoadingBufferDNAgelelectrophoresis(a)Schemeofthemethod;(b)AphotographofagelafterelectrophoresisshowingtheDNAfragmentsasbrightbands.DNAbindstoadyethatfluorescesorangeunderultravioletlight.AnalysisofDNAfragmentsizebygelelectrophoresis.Photographofastainedgelofcommerciallypreparedfragmentsafterelectrophoresis.Thebandsthatwouldbeorangeinacolorphotoshowupwhiteinablack-and-whitephototakenwithanorangefilter.Thesizeofthefragments(inbp)aregivenatright.AnalysisofDNAfragmentsizebygelelectrophoresisGraphofthemigrationoftheDNAfragmentsversustheirsizesinbasepairs.Theverticalaxisislogarithmicratherthanlinear,becausetheelectrophoreticmobility(migrationrate)ofaDNAfragmentsinverselyproportionaltothelogofitssize.However,noticethedeparturefromthisproportionalityatlargefragmentsizes,representedbythedifferencebetweenthesolidline(actualresults)andthedashedline(theoreticalbehavior).ThissuggeststhelimitationsofconventionalelectrophoresisformeasuringthesizesofverylargeDNAs.Pulsed-fieldgelelectrophoresisofyeastchromosomes.Identicalsamplesofyeastchromosomeswereelectrophoresedin10parallellanesandstainedwithethidiumbromide(EB).Thebandsrepresentchromosomeshavingsizesrangingfrom0.2Mb(atbottom)to2.2Mb(attop).Originalgelisablout13cmwideby12.5cmlong.RNA电泳甲醛变性电泳乙二醛变性电泳28S18SHuRatRNA保存剂（新鲜样品）SampleProtector（Takara）RNAINTMRNAlater(Ambion)RNALOCKERRNAwait(上海飞捷)RNAMATE(广州百康)……RNA保存剂（新鲜样品）1.HL60细胞(见图1)。2.大鼠脾脏(见图2)。SummaryDNAs,RNAs,andproteinsofvariousmassescanbeseparatedbygelelectrophoresis.Themostcommongelusedinnucleicacidelectrophoresisisagarose,butpolyacrylamideisusuallyusedinproteinelectrophoresis.SDS-PAGEisusedtoseparatepolypeptidesaccordingtotheirmasses.蛋白质电泳IEF（等电聚焦）isusedtoseparatesproteinsbytheircharge(pI,pointofisoelectric).Native-PAGE(非变性，亚单位不分离)SDS-PAGEisusedtoproteinsbytheirsize(molecularweight,MW).(变性，亚单位分离)聚丙烯酰胺电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶由单体丙稀酰胺和N,N‘-甲叉双丙烯酰胺在加速剂和催化剂（四甲基乙二胺，TEMED）作用下交联成三维网状结构的凝胶。具有如下优点：1、一定浓度下，凝胶透明，有弹性，机械性能好2、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应3、对pH和温度变化较稳定4、几乎无电渗作用，样品分离重复性较好5、样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10－6g6、凝胶孔径可调节7、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中不连续凝胶电泳的分离原理：1、样品的浓缩效应1）凝胶层的不连续性2）缓冲液离子成分的不连续性2、电荷效应各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率也不同3、分子筛效应凝胶浓度不同，网孔径大小不同。分子量和构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，引起泳动速度的变化，从而达到分离目的。影响因素：1、聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小2、缓冲系统3、离子强度聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）SDS-polyacylamidegelelectrophoresisPolypeptidesofthemolecularmassesshownatrightwerecoupledtodyesandsubjectedtoSDS-PAGE.Thedyesallowustoseeeachpolypeptideduringandafterelectrophoresis.Whatis2DGelElectrophoresis?Thisisamethodfortheseparationandidentificationofproteinsinasamplebydisplacementin2dimensionsorientedatrightanglestooneanother.Thisallowsthesampletoseparateoveralargerarea,increasingtheresolutionofeachcomponent.Whatisitusedfor?2Dgelelectrophoresisisgenerallyusedasacomponentofproteomicsandisthestepusedfortheisolationofproteinsforfurthercharacterizationbymassspectroscopyforthelargescaleidentificationofallproteinsinasample.differentialexpression.HowisitPerformed?IEFisusedinthe1stDimension.Thisseparatesproteinsbytheircharge(pI).SDS-PAGEinthe2ndDimension.Thisseparatesproteinsbytheirsize(molecularweight,MW).TheprocedureisknownasISO-DALT:isoforisoelectricfocusinganddaltfordaltonweight.SummaryHigh-resolutionseparationofpolypeptidescanbeachievedbytwo-dimensionalgelelectrophoresis,whichusesisoelectricfocusinginthefirstdimensionandSDS-PAGEinthesecond.分子杂交技术第二节在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分