植物组织培养技术第七章 植物脱毒快繁技术

第七章植物脱毒快繁技术一、病毒危害多数栽培植物，尤其无性繁殖植物，都易受到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如，草莓染60多种病毒。并且随着培养时间的推移，侵染病毒的种类越来越多。植物病毒病原体可通过维管束传导。因此，对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后，就会代代相传越趋严重。受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大幅度下降，品质变劣，甚至完全丧失商品价值。病毒的危害给植物生产带来的损失很大，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产10％~18％，花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。由于病毒对植物造成如此严童的危害，所以世界各国都积极开始重视这方面的研究。小麦黄矮病毒病草莓镶脉病毒西瓜病毒病烟草普通花叶病目前，对细菌和真菌侵染的病害，可通过药物处理达到治愈的目的。但还没有治病毒的特效药。种子一般不带病毒，种子繁殖可得无毒植株。但对于无性繁殖植物，必须采取一些特殊方法脱除病毒。无病毒植株培育的意义1.去除病毒危害，提高作物品质与产量。采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。而通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量。因此，到60至70年代在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。2.减少环境污染，有利于保护环境栽培去病毒植物可减少药剂的使用。二、脱毒方法(一)热处理脱毒（一）发现：1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗(现证明为病毒病)，放在50-52℃的热水中保持30min，甘蔗就可去病生长良好。以后此方法被广泛用于防治许多植物的病毒病。热处理又称温治疗法。•1、热处理脱毒原理：①病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。②热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，能够获得无病毒植株。依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。热处理区低温高温生长区寄主无损伤病原微生物被消除寄主被杀死BAC(1)温汤浸渍处理(2)热空气处理2、热处理脱毒方法（1）.温汤浸渍处理适用：休眠器官、剪下的接穗或种植的材料方法：50℃左右的温水中浸渍10min至数小时特点：方法简便易行，但易使材料受伤。（2.）热空气处理适用：对活跃生长的茎尖效果较好方法：将生长的盆栽植株移人温热治疗室(箱)内，一般在35~40℃下处理几十分钟至数月。处理时间因植物而异，如香石竹于38℃下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在35℃下处理几个月才能获得无病毒苗。特点：热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。因此热处理需与其他方法配合应用，才可获得良好的脱毒效果。热处理广泛应用于葡萄、草莓、马铃薯和菊花等植物。如：葡萄置于38℃可去除扇叶病毒。热处理对葡萄扇叶病毒、草莓斑驳病毒、苹果花叶病毒等球形病毒有作用，而对另一些病毒不起作用，因此，必须与茎尖培养相结合脱毒效果更好。葡萄扇叶病毒苹果花叶病毒1、茎尖培养脱毒原理2、培养基3、茎尖培养方法4、影响微茎尖培养的因素①外植体大小②培养条件③外植体的生理状态（二）茎尖培养脱毒植物的去病毒技术，实质上就是采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0.1～0.5mm带1～2个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。1、茎尖培养脱毒原理病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域，病毒感染的程度越低，生长点即分生组织（约0.1-1mm）几乎不含或含病毒很少。1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。2、当植物细胞分裂DNA复制时，病毒DNA随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占优势，使病毒无法进行复制。3、茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。4、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”，在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：2、培养基一般以White、MS为基本培养基，提高钾盐和铵盐含量有利于茎尖生长。MS培养某些植物茎尖时，有些离子浓度过高应稀释。在双子叶植物中，激素可能在第2对叶原基中合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必须加入生长素与细胞分裂素，浓度要合适。在生长素中应避免用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜用NAA或IBA；细胞分裂素用KT或BA；GA3对某些植物茎尖培养有用。3、茎尖的培养方法需要一台解剖镜（8-40倍）。剥离茎尖要迅速并尽快接种，或在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，以防茎尖变干。茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，(无须表面消毒)就可得到无菌的外植体。有时消毒处理会增加培养物的污染率。即：叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10min。兰花马铃薯茎尖长（ｍｍ）叶原基数小植株数脱毒植株数脱毒率（％）0.1215024480.272421842.90.646400离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易成活，过大又不能保证完全出去病毒，所以茎尖大小要合适。TheApicalMeristem剥取茎尖过程:解剖镜下用解剖针将叶片剥掉，解剖针要常消毒。当一个半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将带1-2个叶原基的分生组织切下，接到培养基上。将接种的茎尖置于22℃左右温度下。2000-3000lx16h/d光照下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同。茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。4、影响微茎尖成活及脱毒的因素（1）母体材料病毒侵染程度被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的较难。（2）外植体大小在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。（2）培养条件在茎尖培养中，光下培养的效果通常比暗培养效果好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时，光照强度便增加到4000lx。（3）外植体的生理状态茎尖最好要由活跃生长的芽上切取。取芽的时间也很重要，一般选萌动期较好。否则采用适当的处理，打破休眠才能进行。（三）茎尖与热处理相结合方法能克服单独茎尖培养时，茎尖过小成活率太低，茎尖太大又脱除不掉病毒的缺点。1、热处理后取较大茎尖培养获得脱毒苗。2、取茎尖（或茎段）培养获得无菌苗。然后将试管苗热处理，再取茎尖培养获得脱毒苗。（四）其它途径脱毒1、愈伤组织培养脱毒2、茎尖微体嫁接3、化学疗法脱毒1、愈伤组织培养脱毒愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分细胞不带病毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。多次继代的愈伤组织中病毒含量下降，甚至检测不出病毒。愈伤组织的某些细胞不带病毒原因：1、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株。理由：①病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；②有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。缺点：植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株（二）茎尖微体嫁接1.概念：将无病毒茎尖（0.4~1.0mm）嫁接在培养基上培养的实生砧木上，以获得脱毒苗木的技术。2.适宜：茎尖培养难以生根的植物，如桃、柑橘、苹果等3.无病毒茎尖来源：成年无病毒植物、温室培养的植物、热处理植物和脱毒试管苗。（三）化学疗法脱毒许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体的培养具有脱毒效果。常用的药品有：8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。例如，将100ug2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。三、脱毒快繁材料的选择应注意以下几点：1）品种要可靠2）要选择经当地栽培确认的高产优质的品种来作为脱毒材料3）名贵的植物良种4）植物生长旺盛期，再生率高，脱毒效果好四、植物病毒的鉴定1、外观判断法2、指示植物法3、抗血清鉴定法4、电子显微镜检查法5、酶联免疫鉴定法(ELISA)1、外观判断法：带病毒株往往叶片发黄，凹凸不平，畸形，可根据这些表现来判断。但有些病毒表现不明显，仅靠这一方法还不够。2、指示植物检测法：指示植物又称鉴别寄主，指的是对某种或某些特定病毒非常敏感，而且症状表现十分明显的植物。通常不同病毒应选用不同的植物。马铃薯病毒常用指示植物有千日红、曼陀罗、豇豆、辣椒等。分为2种①汁液感染法②嫁接检测法千日红曼陀罗豇豆3、抗血清鉴定法（抗原－抗体反应）原理：由于病毒是由蛋白质和核酸组成的，是一种较好的抗原。将病毒给动物注射后产生抗体。抗原和抗体结合产生血清反应。抗原：病毒。抗体：是指生物体在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，主要存在于血清中，含抗体的血清称为抗血清。鉴定方法：抗原的制备→→抗血清的采收，分离→→把稀释的抗血清与未知的病毒植物的汁液在小试管内混合→→根据沉淀反应来鉴定病毒种类。植物无病毒苗的培育3.特点：特异性高（这种抗血清是高度专一性的试剂），测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。植物无病毒苗的培育4、电子显微镜检查法病毒有一定的形态（球状、杆状、线状等）和大小（0.01~0.3um）。采用电子显微镜（分辨率0.0001um）可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，并鉴定病毒的种类。优点：灵敏度高，能在植物粗提取液中定量测定病毒。5、酶联免疫吸附测定法(ELISA)把抗原-抗体的免疫反应于酶的催化反应相结合而发展起来的一种综合性技术，灵敏度高，特异性强，发展最快应用最广的方法。原理：采用酶标记的特异抗体指示抗原-抗体的结合，从而检测样品中的抗原定量测定法。操作程序：将待检植物汁液注入酶联板（聚苯乙烯多孔微量反应板）中，使抗原吸附在它的孔壁，加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的特异抗体，抗原-抗体充分反应后，清洗，固相载体酶联板表面只留下以酶标记的抗原-抗体复合物。加入酶嘚无色底物，复合物上的酶催化底物降解，生成有色物。结果可由肉眼识别，也可用特殊分光光度计对底物的降解量进行测定。五、快速繁殖茎尖培养得到的脱毒苗不多，用于生产需扩大繁殖。扩繁方法：1）组培快繁2）无毒苗栽到土壤中进行扩繁。如甘薯、草莓等利用蔓，马铃薯、姜、蒜等利用地下部分繁殖。为了预防病毒再感染，扩繁应在培育温室或防虫罩内，因为昆虫传播病毒。3）两种方法相结合，试管内扩繁，移栽后再扩繁。注意：1、培养变异的产生，应及时去除2、脱毒苗并非永远是无毒苗，由于昆虫等的传播，不免会再感染病毒，所以要经常脱毒，一般脱毒苗用1－3代。脱毒试管苗为原原种－－繁殖一代为原种－－原1代－－原2代六、脱毒苗在生产中的应用脱毒苗用于生产可以明显提高产量和质量，一般产量可提高30％以上。目前，甘薯、马铃薯、草莓、大蒜、百合花、菊花、康乃馨等都广泛利用脱毒苗。小结：脱毒快繁的一般过程1、诊断：首先了解供试材料感染病毒的种类2、茎尖培养脱毒或结合热处理3、鉴定4、繁殖5、驯化