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《细胞工程》课程论文院系:XXXXXXXXXXXXXXXXXX专业:XXXXXXXXXXXXX姓名:XXXX学号:XXXXXXXXXXX动物细胞培养技术研究概述XXXX(地址,邮编)[摘要]动物细胞培养是生物、生物医学研究和应用中广泛采用的技术方法,可分为原代和传代培养,有贴壁、悬浮和固定化培养等培养方式。细胞生长具有特殊的生物学性质,需要无菌、恒温和充分的营养环境.动物细胞培养技术在拥有广阔的发展空间和光明前景的同时也面临着诸多问题和挑战。[关键词]细胞培养;微载体;中空纤维;微囊法培养一、动物细胞培养的发展动物细胞体外培养最早可追溯到1907年,由美国生物学家Harrison在无菌条件下,以淋巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周,创立了体外组织培养法。此后,随着抗生素、培养基、培养装置以及工艺方法的不断改进,动物细胞培养(Animalcellculture)的研究和应用逐步增多和深入,发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。其发展简史见下表:动物细胞培养技术的发展[1]年份技术发展概要1907年Harrison创立体外组织培养法。1951年Earle等开发了能促进动物细胞体外培养的培养基。1957年Gcaff用灌注培养法创造了悬浮细胞培养史上绝无仅有的1×1010~2×1010cells/L的记录,标志着现代灌注概念的诞生。1962年Capstile成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞(BHK),标志着动物细胞大规模培养技术的起步。1967年VanWbezel用DEAE-SephardiA50为载体培养动物细胞获得成功。1975年Sarto等在培养基中用激素代替血清使垂体细胞株GH3在无血清介质中生长获得成功,预示着无血清培养技术的诱人前景。预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。1986年DemoBiotech公司首次用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞生产单抗获得成功。1989年Constantinople首次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制,更新了传统细胞培养工艺中优化控制之理论。二、动物细胞培养的概念及生物学特性(一)动物细胞培养的基本概念细胞培养是指从体内组织取出组织细胞并模拟体其内生存环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。从体内取出细胞首次培养即为原代培养(PrimaryCulture),这是细胞培养的最初和必经阶段.当原代培养细胞生长到一定时期,受到群体环境限制,就需要转移到另一容器才能继续生长,称为传代或继代培养(Subculture)。根据原代培物性状的一致性与否,传代成功后称为细胞系(Cellline)或细胞株(CellStrain)。这些细胞一般可顺利传40~50代次,并保持染色体二倍体数量和接触抑制,传至50代左右时则出现生长停滞,大部分衰老死亡,此类称为有限细胞系/株;在细胞传代的过程中,有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株[2]。(二)动物细胞培养的生物学特性动物细胞无细胞壁,机械强度低,对剪切力敏感,适应环境能力差;倍增时间长,生长缓慢,易受微生物污染;对生长环境和培养环境要求苛刻。1.细胞生命周期性变化[3]体外培养的细胞从适应环境、旺盛生长到由于自身和环境限制缓慢或停滞生长经历一个周期变化。(1)、潜伏期(Latentphase)细胞从接种到适应新环境生长繁殖的一段时间,此间细胞胞质回缩,代谢缓慢.(2)、指数生长期(Logarithmicphase)指数生长期是细胞活力最好的时期,细胞增殖旺盛.在接种细胞数量适宜的情况下,指数生长期持续3~5d后,随细胞数量不断增多,生长空间日趋减少,营养环境恶化,呈现接触抑制(Contactinhibition)。恶性细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制(Densityinhibition)。(3)、稳定期(Stagnatephase)细胞数量达到饱和密度后,细胞与营养液的交换面积减少,代谢产物积累,pH值下降,细胞停止增殖,进入停滞期.营养环境继续恶化后,细胞受损直至死亡。2.细胞培养环境和生长条件(1)、无菌无毒环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件.在体外培养的细胞,由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,就可能会导致细胞中毒死亡。因此,在体外培养细胞时,应及时清除细胞代谢产物,以保持细胞生存环境无菌无毒。(2)、恒温要维持培养的细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.偏离适当的温度范围,细胞会受到损伤,影响正常代谢甚至死亡。(3)、气体环境气体主要是O2和CO2,O2可以给细胞提供能量,而CO2不仅是细胞增殖所需的物质,也是其自身的代谢产物,此外,CO2还有着调节培养基pH的作用。(4)、缓冲环境缓冲环境的作用是为细胞提供一个酸碱度在培养细胞生理范围内的培养液,提供水分和无机盐,维持细胞的正常代谢。(5)、培养基培养基是细胞培养中供给细胞营养和促进增殖的基础物质,分为天然培养基和合成培养基两种,它是细胞生长繁殖的直接环境,天然培养基从动物体液或组织中分离提取,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等;合成培养基是根据天然培养基的成分,模拟合成、配制的培养基.它包含细胞生长的无机盐、氨基酸、维生素、糖类等基本物质和一些特殊的添加成分结合适量添加血清,广泛应用于动物细胞培养。三、动物细胞培养的方式(一)贴壁培养(Monolayerculture)贴壁培养主要适用于贴壁依赖性细胞.一般源于实体组织的细胞需要相互依赖,需贴附于不起化学作用的物质(玻璃或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持,并最终在附着面生长至单层,铺满平面时便会发生接触抑制。(二)悬浮培养(Suspensionculture)悬浮适应细胞、源于循环系统的细胞及肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞无需支撑面,细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖.悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。(三)固定化培养(Immobilizingculture)固定化培养是一种包埋培养方式,适用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞.它具有剪切力低、传递效果好和抗污染能力强、细胞生长密度高、产物易于收集和分离纯化等特点。(四)微载体培养(Micro-carrierculture)传统的贴壁依赖性细胞的培养通过静止或转瓶等培养来获得,操作繁复,且耗费空间及人力。1967年,VanWezel首次提出了“微载体”培养系统,使贴壁依赖型细胞贴附在微载体上悬浮于液体培养基中生长,兼具平板培养和悬浮培养的优势,增加培养面积同时获得均一的环境培养条件(温度、PH值、CO2浓度、葡萄糖浓度等),便于控制放大获得高密度培养细胞和优化下游控制。(五)中空纤维培养(Hollowfibresculture)1972年,RichardKnazek首次报道该技术[4]。该技术是模拟细胞在体内生长的三维状态,利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。中空纤维表面具有海绵状多孔结构,既能使水分子、营养物质和气体透过,也能使细胞在上面贴附生长.该技术的特点是:细胞培养环境温和,培养细胞密度较高,产品较容易分离纯化[5]。(六)微囊法培养[6](Micro-encapsulationculture)微囊化培养技术是20世纪70年代由Lin和Sun创建的一种大规模培养技术[4].其要点是:在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再将微囊放入培养系统内进行培养.微囊化培养有一些突出的优点。首先,细胞能生长和维持在小体积的培养液中,这使培养液中的分泌产物变浓,简化了下游加工。其次,培养液易于迅速改变,且无分离细胞与培养液的困难。最后,微囊固定化细胞较少暴露于物理损伤环境。这种技术最早由Lima[7]等人提出,Da-monBiotech公司[8]最先实现工业化。他们用一层非常薄的聚赖氨酸壳把杂交瘤细胞囊括起来,形成200μm直径的小球,从培养开始大约10天,杂交瘤细胞可长满微囊。据报道,微囊中单抗浓度很高,可达2.5g/L,且无其它杂蛋白,容易获得高纯度单抗。目前,微囊工艺已用于生产以克计的单克隆抗体。高表达有工业价值蛋白质的重组细胞近年来亦更多地用微囊化培养[9]。四、动物细胞培养存在的问题近一个世纪以来,人类对动物细胞培养技术的大量研究和开发,并取得了一定的进展。但目前的技术水平还远不能满足细胞生物制品开发和生产的要求。目前存在的问题主要有:各类动物细胞培养技术水平发展不均衡,特别是低等动物类细胞培养的技术和方法尚不成熟。1.动物细胞培养效率较低,其成活率和利用率也不理想。2.在大规模、长时间的人工培养过程中,细胞群体的生理机能受到影响,如分泌和代谢能力的丧失或代谢产物的活性降低等。3.动物细胞培养所用的培养设备以及培养用微载体等耗材昂贵,造成研究和开发的成本增加,这也成为限制动物细胞培养工程在中国大规模的开展的重要原因之一[10]。五、前景与展望在目前和今后若干年内,在可表达复杂真核基因的微生物系统及用作生物反应器的转基因动物系统尚未成功开发之前,动物细胞作为一种日趋成熟的表达系统,会愈来愈受到研究人员和生产人员的重视,并将成为基因工程和细胞工程中十分活跃的领域,众多的产物必须依靠这种系统进行表达与生产。展望未来,动物细胞培养工程发展的总方向是:1.大型化、自动化、精巧化、低成本、高细胞密度、高目的产品产量。具体地说,就是开发能高密度生长、能分泌大量目标产品的细胞系。这些细胞系应具有放大的目的基因或具有选择性标记,从而可以保持对特定产物的表达。2.开发细胞生长性能优良、解离细胞容易,并能重复使用的新型廉价微载体。3.研制更大规模的高无菌条件的生物反应器和剪切力小、混合性能良好的新型搅拌系统。4.将其它领域(诸如自动控制、传感器)的高精尖技术移植于细胞培养工程领域,以提高大规模培养的自动化、精巧化水平,并能更经济地设计流加或灌注培养过程。5.由于某些生长因子基因在导入哺乳动物细胞后,其表达产物有可能使细胞脱离血清生长,这一途径对于今后的哺乳动物细胞基因工程有很大吸引力,并将推动无血清培养基的开发进入一个崭新阶段。参考文献:[1]赵佼,谭文松,俞俊棠.大规模动物细胞培养技术研究进展.华东理工大学学报1997-04[2]孔永,秦秀云.动物细胞培养技术研究进展.重庆文理学院学报(自然科学版)2007年8月第26卷第4期[3]王捷,等.动物细胞培养技术与应用[M].北京:化学工业出版社,2004:1-9[4]石凯,熊晓辉,许建生.固定化动物细胞大规模培养技术研究进展[J].化工进展,2002,21(8):556-559.[5]MaryaIC,JulioAL,RicardoJG.Solvingdesignequationsforahollowfiberbiioreactorwitharbitrarykinetics[J].ChemicalEngineeringJournal2001(84):445-461[6]赵佼,谭文松,俞俊棠.大规模动物细胞培养技术研究进展.华东理工大学学报1997-04[7]LimaF,MlossRD.Mencapsulationoflivingcellsandtissues.JPharmSci,1981,70[8]BellicoseEG.Mencapsulationtechnologyforlarge-scaleantibodyproduction.Bio/Technology,1986,4(2):114~117[9]朱冬发,李士云,谷鑫松,等.HPLC监测微囊化细胞培养中乳酸和丙酮酸的变化.生物化学与生物物理学报,1994,26(5):571~575[10]侯雪芹,林小桦,李薇.动物细胞培养技术研究的现状与思考.辽宁中医药大学学报.第12卷第11期2010年11月
本文标题:细胞工程课程论文
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