高效液相色谱-(2)

高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography)河南省畜产品质量监测检验中心HPLC为什么要学习并掌握HPLC呢？我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较方法项目数量1985年版1990年版1995年版2000年版2005年版HPLC法鉴别93495133检查1240100124含量测定760117287324鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，并且在饲料、饲料中药物检测、畜产品残留检测方法中的应用日益广泛，高效液相色谱仪也将由原来尖端的精密仪器发展成为一个常规的分析仪器。因此每一个分析人员应该掌握并应用好HPLC。一、概述1、液相色谱理论发展简况色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。色谱法的分离原理溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。2、HPLC的特点和优点高压——压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。高速——流速为0.1~10.0ml/min。高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。3、色谱法分类按两相的物理状态可分为：液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。（此外还有电泳。）高效液相色谱法分类按分离机制液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。目前我们常用的就是：液液分配色谱法（正相与反相），其中反相最广泛，占整个HPLC应用的80%左右液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法的分类液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)正相、反相色谱法比较极性常用固定相常用流动相正相色谱固定相流动相聚乙二醇、氨基与腈基键合相正已烷、环已烷，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。反相色谱固定相流动相非极性固定相（如C18、C8）水或缓冲液、甲醇、乙腈、常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间应用最普遍的反相色谱反相色谱：基于分子的极性分离洗脱次序：极性高的先被洗脱常用的流动相：水和有机溶剂如甲醇、乙腈应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：C18、C8、苯基等基团反相色谱固定相多为键合相正相色谱与反相色谱的比较项目正相色谱反相色谱填料极性极性非极性流动相极性非极性极性洗脱次序极性最弱的最先被洗脱极性最强的最先被洗脱流动相中极性溶剂(水)量增加保留降低保留增加常用流动相己烷，氯仿，异丙醇等甲醇、乙腈，水典型色谱柱硅胶(Silica)C18/C8二、基本概念1．色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。基线(baseline)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。标准偏差(standarddeviation，σ)——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。峰面积(peakarea，A)——峰与峰底所包围的面积。色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。峰底——基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peakheight，h)——峰的最高点至峰底的距离。峰宽(peakwidth，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ半峰宽(peakwidthathalf-height，Wh/2)——峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ色谱参数tR=保留时间R:分离度t0=死时间K´:容量因子W=峰底宽度DetectorResponseTimeABWWABInjectt0tR(A)tR(B)tR(B)-tR(A)WA+WBR=2tR(B)-tR(A)W1/2A+W1/2B=1.176K´=tR-t0t02．定性参数（保留时间）保留时间(retentiontime，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。3．柱效参数理论塔板数(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。InjecttRWWTime1/2B理论塔板数和理论塔板高度的计算方法理论塔板数N=16(tR/WB)2=5.54(tR/W1/2)2理论塔板高度HETP=L/N用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。理论塔板数N=5.54(tR/W1/2)24．相平衡参数(1)分配系数(distributioncoefficient，K)——在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比.(2)容量因子(capacityfactor，k)——化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。(3)选择性因子(selectivityfactor，α)——相邻两组分的分配系数或容量因子之比。5．分离参数分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。《中国兽药典》规定R应大于1.5。tR(B)-tR(A)WA+WBR=2tR(B)-tR(A)W1/2A+W1/2B=1.176影响分离度(R)值的因素ΔtW=R=1/4Nxα-1xk'1+k'容量因子选择性柱效α提高分离度有三种途径①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内，最好为2~5，窄径柱可更小些。三、HPLC系统HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。1.输液泵（1）．泵的构造和性能输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。2．泵的使用和维护注意事项为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用Millipore滤膜（0.2µm或0.45µm）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。3.故障排除如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障：①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。②压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。4.梯度洗脱注意事项①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集