第十二章植物组织培养室的构建及培养基、植物材料消毒液

第二章植物组织培养实验室的构建及植物组织培养基植物组织培养实验室的构建主要内容：一、植物组织培养实验室设计二、仪器和设备三、玻璃器皿和用具四、培养条件一、实验室设计标准组织培养室包括洗涤室（区）制备室（区）灭菌室（区）储放室（区）操作室（区）培养室（区）观察室（区）药品室（区）１、洗涤室（区）玻璃器皿和塑料器皿１、洗包括用自来水、洗液、洗涤剂清洗２、干包括自然晾干和烘箱干燥2、药品室存放常用的化学试剂无机盐类、有机物、生长调节剂等3、制备室完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器.•培养基的配制•生理生化测定4、储存室（区）•存放配制后的培养基•或未用完的培养基5、灭菌室即消毒室，是培养基、玻璃器皿、塑料器皿和其他物品消毒灭菌的地方6、操作室•也称接种室，是开展组织培养研究包括接种、继代、细胞融合等的场所。主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。•接种室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。7、培养室•培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养室：植物组织培养材料移到田间前，先移到驯化室进行炼苗，带生根成活后，再移到田间苗圃。二、仪器和设备1、烘箱•陈列于洗涤室•作用：干燥洗后的器皿高温干热灭菌测定培养物的干重气浴2、冰箱•陈列于制备室中•作用：低温保存材料，存放药品、培养基母液激素、酶制剂。3、灭菌锅•陈列于灭菌室中•类型：普通医用消毒锅大的高压灭菌锅•作用：培养基、水和各种器皿的消毒4、超净工作台•陈列于操作室（接种室）中•类型：垂直式和水平式•作用：无菌操作5、pH计•陈列于制备室中•作用：测定培养基及酶液的pH值6、显微镜•陈列于观察室中•类型：倒置显微镜原生质体观察普通显微镜染色体和叶片气孔观察荧光显微镜细胞活力观察解剖显微镜立体观察7、天平•陈列于制备室中•作用：称取大量元素、微量元素、酶制剂三、玻璃器皿及用具1、玻璃器皿培养用的：试管、三角瓶、培养皿等显微镜下观察用的：细胞微室、载玻片、培养皿等。2、微孔过滤器（细胞过滤器）•灭菌用：如激素•一般用石棉滤膜3、细胞计数器统计培养细胞的用具4、接种用具如镊子、剪刀、解剖刀、接种针等思考题1、一个正规的组织培养实验室应具备哪些房间？2、组织培养常用的设备有哪些？各有何用途？3、组织培养的环境条件有哪些？培养基的成分培养基的制备培养基的选择培养基的制备是组培的核心工作，外植体之所以能沿着不同的组培途径生长、分化、成苗都取决于选用不同成分的培养基来调节控制的。培养基的成分其它添加物固化剂植物生长调节剂有机营养成分无机营养成分培养基组成无机营养成分+有机营养成分=基本培养基1.无机营养成分：1)大量元素：指浓度大于0.5mmol／L的元素。（C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca）氮：由硝酸盐和铵盐提供铵盐过高会引发玻璃化苗2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。（Fe，Cu，Zn，B，Mo，Mn等）微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。Fe由螯合物的形式提供:Na2.EDTA无机盐供应不足时，植物会出现缺素症状。1、无机营养成分＊当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现出来的症状如下：氮：某些组织表现出一种花色素苷的颜色；不能形成导管；氮，钾或磷：细胞过度生长，形成层组织减退；硫：非常明显的褪绿；铁：细胞分裂停止；硼：细胞分裂停滞，细胞伸长；锰或钼：影响细胞伸长。不同营养条件对植物组织培养的影响-MSSaltsGrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.MSsaltsreducedto0.47g.l-1Somerootgrowthbutreduceddevelopmentofshoots（1/10）MSMSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.(2MS)碳源：最常用的是蔗糖，提供碳源；维持培养基渗透压。葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%—3%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%，但在胚培养时采用4%-15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。2、有机营养成分维生素：维生素(vitamin)这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上，还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用VH(生物素)、VB11(叶酸)、VB12（钴胺素)等。一般用量为0.1—1.0mg／L。有时用量较高。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。氨基酸(AA)：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-000mg/L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。天然复合物：其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。•1)椰乳是椰子的液体胚乳。•2)香蕉主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。•3)马铃薯(potato)去•4)水解酪蛋白•5)其他酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)肌醇(myo—inosltol)又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。使用浓度一般为100mg/L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.Theresultiscomparablewiththecontrolmedium不同营养条件对植物组织培养的影响-sucrose3、植物生长调节物质在培养基的各成分中，植物激素是植物培养基的关键物质，它以很微小的量影响着再生植株的形态建成。基本培养基保证培养物的生存和最低的生理活性植物激素定向的诱导外植体的生长分化国际植物生理协会公布的植物激素包括：赤霉素（GA）细胞分裂素(CTK)生长素(AUX)乙烯（Eth）脱落酸（ABA）油菜素内酯（BR）作用：顶端分泌，诱导细胞分裂，促进生根。用量：mg/L（1）生长素(AUX)：吲哚乙酸：IAA（indoaceticacid）萘乙酸：NAA（naphthaleneaceticacid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyriacid）2,4-二氯苯氧乙酸：2,4-D(2,4-dichlorophenoxybutyricacid)用法：溶于95%酒精或者NaOH种类：生长素作用强弱顺序：IAANAAIBA2,4-D强弱2，4-D常用于诱导愈伤组织，IBA和NAA常用于生根NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.Extensivecallusgeneration(1/5)NAAPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceNAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.Somecallus(10xNAA)不同营养条件对植物组织培养的影响-AUX种类：6-BA(6-苄基腺嘌呤)Kt(kinetin激动素)Zt(zeatin玉米素)TDZ（Thidiazuron）用法：溶于0.5MHCl和NaOH（2）细胞分裂素(CTK):作用：根尖分泌，促进细胞分裂,诱导芽的分化，延缓组织衰落。GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceNoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant不同营养条件对植物组织培养的影响-CTK(1/5BAP)GA3：作用：促进幼胚发育，促进细胞伸长，打破休眠。用法：易溶于水，一般用95%的酒精配成母液贮存。（3）赤霉素(GA)（4）乙烯作用：催熟，促进植物落叶、早衰等，影响培养物的生长和分化。（5）脱落酸作用：促进脱落和衰老，在组培中或许促进，或许抑制愈伤的分化作用：作用可能与CTK类似，但是用量远小于CTK。（6）油菜素内酯生长素促进DNA的复制赤霉素促进G1-S,并缩短S期细胞分裂素促进细胞质的分裂琼脂是一种由海藻中提取的多糖类物质，本身并不提供任何营养，40℃凝固。固体培养时最好的固化剂。用量：0.7%-1%。4固化剂-琼脂活性炭(activecarb