组织学制片技术

组织学技术一、组织学技术的应用二、组织学制片技术的分类三、组织学制片步骤四、玻璃器皿的清洗五、盖玻片的清洗六、载玻片的清洗七、玻璃器皿洗涤剂配法一、组织学技术的应用组织学技术包括、组织学制片技术、胚胎学制片技术、组织化学技术、荧光组化及免疫组化技术、组织培养技术、各种特殊显微技术、电镜组织学技术。组织学技术不但应用于组织学本学科，并且广泛应用于其他多学科，如生物学、解剖学、病理学、肿瘤学、法医学、临床诊断学等。二、组织学制片技术的分类组织学制片技术包括普通制片方法和特殊制片方法。制片方法又分为切片法和非切片法两种。切片法分为石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片、等。非切片法分为铺片、涂片、分离片、磨片、整装片、超活体染色等。三、组织学制片步骤取材固定冲洗脱水透明浸蜡包埋修块切片贴片烤片染色封片观察结果（一）、组织取材1动物的处死有麻醉放血处死法、有直接放血处死法。（1）吸入麻醉法、将浸透乙醚的棉花放入玻璃缸内,将动物放入玻璃缸内,盖上玻璃盖，观察动物麻醉情况，放血处死,此法用于小动物。（2）注射麻醉法、用3%戊巴比妥钠按每公斤体重1—2ml静脉注射或腹腔注射，麻醉后立即放血处死,此法用于大动物。（3）直接处死法、用金属器械猛击动物的后脑部或直接断头放血处死,此法适合于小动物。2动物的选择动物的选择是组织切片取材的第一步,在组织学中以人的组织为理想，但人的组织不易得到，根据教学的需要,大都以动物的组织来代替。但有些动物的组织器官比人的组织更为典型，如：猪的肝脏、豚鼠胰腺、内耳、猫的肋间肌显示运动终板，兔的皮下组织和肠系膜作活体染色较为理想。（1）猴：神经系统、循环系统、淋巴系统、内分泌系统、泌尿系统、雌雄生殖系统和特殊感官等。（2）狗：呼吸系统、循环系统、泌尿系统、淋巴系统、内分泌系统、神经系统等。（3）猫：消化系统、泌尿系统、内分泌系统、神经系统、肌肉组织等。（4）兔：皮下组织、肠系膜、卵巢、肺、耳壳等。（5）羊：心脏、膀胱、雌雄生殖系统等。（6）猪：肝脏、骨髓、脑垂体等。（7）豚鼠：胰腺、内耳、肾上腺等。3取材注意事项：（1）动物放血处死后立即取材，最好在心脏还在跳动时立即取材，马上投入固定液中，（2）切取组织的刀剪必须锋利，切分组织块时，不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压。以免损伤组织。（3）取材时确定部位和切面的方向。（4）组织块应力求小而薄,一般长为0.5厘米宽为0.5厘米厚为0.2厘米,（5）取材应注意清洁，组织块上如有血液、污物和粘液沾着，应用生理盐水洗涤后再入固定液。（二）固定1固定的目的（1）能迅速阻止死后变化，防止组织的自容与腐败。（2）使细胞内物质凝固成不溶性物质,如蛋白质、脂肪、酶等。（3）使组织产生不同的折光率,染色后便于鉴别和观察。（4）对组织有媒染作用，使不同组织成分对染料有不同的亲和力。（5）能使组织硬化。（6）能细胞各部分清晰。2固定的方法（1）小块组织固定、从人体或动物取出组织，切从小块投入固定液中固定。（2）局部注射固定、某些组织和器官其固定液不易渗透或渗透较慢，渗透不均匀，还有些器官为保持外型或卷缩，可采取局部注射固定方法，固定4—6小时后，再将组织切成小块继续投入固定液中固定。（3）整体注射固定、此法主要用于科研和大体解剖，亦可用于组织学教学制片。3固定液固定液分为单纯固定液和混合固定液两种。单纯固定液（1）甲醛、它是一种还原剂，呈酸性,原液浓度为37%—40%，配成固定液的浓度为4%，习惯上称为10%，配制时取甲醛原液10ml，加D.W或缓冲液至100ml,为甲醛固定液。甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁使其沉淀为2CM，pH为7.6，也可以加粉笔数根，可长期保持中性。加碳酸钙pH为6.5,固定后，可以直接进入脱水剂脱水，如固定时间较长，需在流水中冲洗24—48小时,否则影响染色效果。（2）酒精、它是一种还愿剂，用于组织固定以95%的浓度为宜，酒精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固定，（3）升汞、有称氯化汞，为剧毒药品，使用时特别注意，它与其它药物混合使用对细胞核和细胞质固定良好。（4）苦味酸、为黄色结晶，干燥易燃烧、爆炸，通常加入蒸馏水制作饱和液保存，它的渗透力弱，一般不单独使用，与其它药物混合使用。（5）冰醋酸、含量为99%，在低温时结成冰状，对染色质固定良好，所以在多种混合固定中液都用它。（6）重铬酸钾、水溶液呈弱酸性，它为强氧化剂，不能与酒精等还原剂混合，但与甲醛混合也不能保存过久一般在12—24小时失去作用，重铬酸钾固定组织穿透速度快。但必须流水冲洗。混合固定液、上述某一种单纯固定液不能将组织内的各种成份保存下来，各种药物均有选择性，渗透能力也不同，收缩或膨胀也不相同，因此多配成混合固定液。（1）Zenker氏液重铬酸钾2.5g升汞(绿化汞）5gD.W100ml此液为Zenker氏保存液(在临用时取保存液100ml,加冰醋酸5ml即为Zenker氏固定液)。（在临用时取保存液100ml,加商品甲醛5ml即为Helly氏固定液）此两种固定液，对细胞质和细胞核固定很好，Helly氏固定液对神经系统固定较好，固定时间24小时，流水冲洗24小时，染色时必须去汞处理。（2）Susa氏液升汞(氯化汞）4.5g氯化钠0.5g三氯醋酸2gD.W80ml冰醋酸4ml甲醛20ml(后两种成份在临用时再加入)此固定液渗透速度快，对组织收缩小是一种优良的固定液，特别对消化系统、呼吸系统、肌肉组织的固定效果好，固定时间6—12小时,固定后不经冲洗,可直入70%酒精脱水,但组织切片染色时必须去汞。（3）Bouin氏液苦味酸饱和水溶液75ml甲醛25ml冰醋酸5ml此液为胚胎学与组织学常用固定液，渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为12-24小时,但固定过久,对碱性染料着色不利。（4）Regaud氏液3%重铬酸钾水液80ml中性福尔马林20ml此液必须现配现用，此液为线粒体、嗜铬细胞和神经胶织细胞的优良固定剂。固定时间2-3天后，再以3%重铬酸钾固定5-7天，固定后流水冲洗。（5）Carnoy氏液纯酒精60ml氯仿30ml冰醋酸10ml此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时间2—4小时，它是细胞极好的固定液适合于细胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水。4组织固定应注意的问题（1）所取的组织材料必须新鲜，动物死后在半小时内固定为最好，组织块不能太大。必须在0.5cm长、0.5cm宽、0.2cm厚（2）根据所取的材料要求和实验的需要，选择合适的固定液，（3）固定时间，根据组织块的大小和气温可按具体情况增减，一般以24小时为宜，（4）固定液的量，一般以组织的大小30倍为宜，可在固定组织的器皿底下垫上脱脂棉或纱布，使固定液渗透组织均匀。（5）柔软的新鲜组织不易切成小块，先整体固定或注射固定，使组织硬化后再切成小块继续固定。（二）组织冲洗组织经固定液固定后，一般必须用水冲洗，冲洗的目的。一方面是停止固定液对组织继续固定，另一方面是除去组织中的固定液，（1）瓶装冲洗法、将固定好的组织放入广口瓶内，在瓶口上系好纱布，用一根橡皮管，一头插入瓶口内，一头接上水龙头上，开启一定的水流量，冲洗24小时。（2）水槽冲洗法、用一个有机玻璃制作的水槽盒，将固定好的组织倒入水槽盒内，在水龙头下，开启一定的水流量，冲洗24小时。（四）组织脱水组织经水冲洗后,含有较多的水分，必须用脱水剂除去组织内所含的的水分，才能进行下一步组织透明和石蜡包埋，在普通组织学制片中，脱水剂的种类很多，通常多用酒精脱水，脱水剂在任何条件下必须都能与水混合，同时又能与透明剂混合，为了减少组织的收缩和硬脆，脱水剂由低浓度到高浓度逐级上升，脱水的时间应根据组织块体积和厚度而定。组织脱水过程和时间2—3mm厚的组织脱水时间50%6-8小时95%（2）2-4小时70%6-8小时100%（1）1-2小时80%4-6小时100%（2）1-2小时95%（1）2-4小时（五）组织透明组织经酒精脱水后，还不能进行浸蜡包埋，因组织内含有酒精成分，酒精不能与石蜡混合，需要经过一种酒精与石蜡之间的媒浸物，即透明剂，透明剂即能与酒精混合又能与石蜡混合，透明剂则能取代酒精，使组织成透明状态，液状石蜡能取代透明剂而浸入组织间隙中，这样便十顺利的达到组织埋藏的目的。在组织学中透明剂的种类很多，一般常用的透明剂是二甲苯，易挥发，有一定毒性，透明力强，组织在二甲苯中时间不宜过久，否则组织易收缩变硬变脆，在浸入二甲苯透明之前，组织必须经二甲苯和纯酒精各半的混合液中过度，然后再进入二甲苯透明，透明时间二甲苯纯酒精液中2-3小时二甲苯（1）中1-2小时二甲苯（2）中1-2小时（六）组织浸蜡浸蜡是石蜡包埋的重要过程,将透明的组织进入熔化的石蜡中,让液状石蜡通过组织的间隙浸透到组织中去,然后包埋成组织蜡块,便于石蜡切片。石蜡分为软蜡和硬蜡,熔点在54-56℃为软蜡,熔点在56-58℃或60-62℃为硬蜡，组织浸蜡先软蜡后硬蜡。组织浸蜡的过程和时间组织浸蜡的全过程必须在60℃的恒温箱中进行，在恒温箱内放入2-4个蜡杯，分别放入软蜡和硬蜡使之熔化，将已透明的组织放入软蜡浸20分钟，然后移硬蜡浸40分钟，组织体积的大小与浸蜡的时间有关，请参看组织学与组织化学一书的34页表格。（七）组织包埋组织浸蜡完毕后，要进行石蜡包埋，石蜡包埋操作过程（1）组织进入硬蜡后，开始作包埋准备。（2）将金属包埋框装好在保温台上。（3）将熔点为60-62℃石蜡置电炉上熔化，温度控制在65℃左右，（4）点燃酒精灯，准备好无齿镊，需作标记的写好标签，（5）包埋开始，将熔化的包埋石蜡（温度在65℃左右）倒入金属包埋框内，倒满为即可，（6）用无齿镊从60℃恒温内把浸好硬蜡的组织取出迅速放入包埋框内，待冷却凝固。石蜡包埋注意事项（1）组织从硬蜡中取出放入包埋框内要快,不能在空间停留过久，否则组织表面上的蜡会被凝固.（2）组织包埋时,要确定组织切面和方向。（八）组织修块将已凝固的蜡条从包埋框取出，修成蜡块,在修块时刀子不能挨着组织切下去,蜡块四周要留0.2cm的蜡边.蜡块修好后放入冰箱中保存备用.(九)组织切片（1）磨好切片刀，刀口要锋利，用显微镜检查刀口有无缺口，（2）把被切的蜡块固定在切片机的载物头上，调整蜡块平面。（3）把切片刀固定在切片机的刀架上，调整好蜡块与刀口的距离，调整切片厚度，一般4-6微米，摇动切片机切片。石蜡切片常遇到的问题和解决的方法，见组织学与组织化学技术一书的40-41页。（十）组织贴片贴片方法有三种（1）直接贴片法（2）伸展器贴片法（3）温水漂浮贴片法（十一）烤片（十二）组织染色染色的步骤（1）组织脱蜡（二甲苯1）10-15分钟（2）组织脱蜡（二甲苯2）3-5分钟（3）组织进入100%酒精2-3分钟（4）组织进入95%酒精2-3分钟（5）组织进入70%酒精2-3分钟如固含有汞的固定液固定的组织必须进入碘酒精去汞，（6）组织进入1%碘酒精2-3分钟（7）自来水洗0,5-1分钟（8）5%硫代硫酸钠1-2分钟（9）自来水洗0,5-1分钟（10）蒸馏水洗0.5-1分钟（11）组织进入苏木精染色10-15分钟（12）自来水洗0,5-1分钟（13）0.5%盐酸酒精分色10-20秒（14）自来水洗0,5-1分钟（15）在普通水中蓝化10-15分钟（16）进入伊红染色3-5分钟（17）进入95%酒精（1）分色1-3分钟（18）进入95%酒精（2）脱水2-3分钟（19）进入100%酒精（1）脱水2-3分钟（20）进入1005酒精（2）脱水2-5分钟（21）进入二甲苯（1）透明30分钟-1小时（22）进入二甲苯（2）透明30分钟（23）用中性树胶封固（24）结果观察四玻璃器皿的清洗（1）脏的玻璃器皿在水中浸泡1-2天（2）用毛刷和肥皂粉刷洗干净，在流水下冲洗干净晾干,入硫酸洗涤剂中浸泡1-2天，（3）从硫酸洗涤剂中捞出，在流水下冲洗数小时，尽量把酸冲洗