分子生物学复制

基因信息的传递地球生命的传奇生命简史TheBigBang150－200亿年MilkyWaygalaxy136亿年solarsystem46亿年TheLifeStory40亿年古细菌、真细菌、真核原生生物TheLifeStory40亿年寒武纪生命大爆炸5－6亿年多细胞生物植物登陆4亿年动物登陆3.6亿年哺乳动物诞生2.3亿年灵长类动物诞生5500万－8000万年人类直系祖先诞生700万－500万现代人诞生5－10万年人类文明史1万年科学家复原的“杜马伊”形象学科简史1859年CharlesRobertDarwin1865年Mendel’sPea1941年OneGene,OneEnzyme1953年DNAdoublehelix1966年GeneticCodeCracked1972年FirstrecombinantDNA1982年Firsttransgenicmice2003年人类基因组测序基本完成分子生物学发展阶段准备和酝酿阶段蛋白质是生命的主要基础物质生物遗传的物质基础是DNA现代分子生物学的建立和发展阶段遗传信息传递——中心法则的建立分子生物学发展阶段初步认识生命本质及改造生命的深入发展阶段重组DNA技术的建立和发展基因组研究的发展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展基因表达调控机理细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域第十章DNA的生物合成BiosynthesisofDNA复制过程起始、延伸、终止损伤修复光、切除、重组、SOS修复复制条件其它蛋白酶聚合酶引物酶—引发体连接酶复制特点半保留复制半不连续合成——冈崎片断复制DNA遗传信息亲代——子代；转录和翻译——基因表达基本的三类RNA制造蛋白质，决定生物的表现型中心法则thecentraldogma中心法则的补充RNA病毒复制RNA遗传信息亲代——子代逆转录RNA——DNADNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDP复制（DDDP）转录（DDRP）翻译DNARNA蛋白质反转录（RDDP）RNA复制（RDRP）第一节复制基本规律——复制的特点一、半保留复制semiconservativereplication亲代DNA链为模板，合成子代DNA链子代DNA双链中含一条亲代DNA链DNA复制机制的三种假说使子代DNA与亲代DNA不同1958年M.Messelson和F.Stahl15N培养基→14N培养基提取DNA，作密度梯度离心复制基本方式的证明阐明半保留复制的意义从原则上保证了遗传的相对保守性奠定了DNA是遗传物质的地位二、复制起始点originDNA复制从特定的位点起始（复制子）富含AT原核生物一个真核生物多个三、双向复制bidirectionalreplication复制起始点为中心，向两个方向同时进行复制微生物中，也可进行单向复制如滚环复制四、需要引物primerDNAPolymerase不能从头开始只能延伸已有核酸链引物酶Primase合成一小段RNA链(引物)提供3’端自由羟基（3’-OH）引物的大小原核生物:50～100个核苷酸真核生物：约为10个核苷酸五、半不连续复制DNA聚合酶合成方向5‘——3’DNA双链逆向平行DNA的解链和复制同时进行5′端3′端CGA5‘——3’ATATTTTTTATATATATTTTTT领头链(leadingstrand)连续随从链(laggingstrand)不连续冈崎片断(Okazakifragment)原核生物1K～2K真核生物100第二节酶学和拓扑学变化DNA复制的条件底物&模板解旋解链DNA聚合酶DNA连接酶底物substrate模板templatedATP，dGTP，dCTP，dTTPDNA复制是模板依赖性的(dNMP)n+1+PPi(dNMP)n+dNTPDNA解链及拓扑学变化理顺DNA链拓扑异构酶(gyrA,B)稳定已解开的单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白质（基因）通用名功能原核生物复制起始的相关蛋白质解螺旋酶（unwindingenzyme）解链酶或rep蛋白解开DNA双链2ATP/bpbasepair解螺旋酶引发体和RNA引物引发体:引发前体+引物酶引发前体:由若干蛋白因子聚合而成DnaA蛋白识别复制起始点，并具有ATPase活性。引物酶特殊的DDRP单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）稳定ssDNA，便于复制保护ssDNA，免受核酸酶的降解拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中的一条链松开双螺旋后再将DNA链连接起来避免出现链的缠绕。拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。解链过程中正超螺旋的形成DNA聚合酶(DDDP)（一）种类和生理功能：原核生物DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）1958年A.KornbergDNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）主力polⅢ由十种亚基组成全酶的核心部分（核心酶）α、ε和θ三种亚基组成α亚基5’→3’聚合活性ε亚基3’→5’外切活性保证DNA复制的精确性/保真性polⅢ无5’→3’外切活性外切酶活性的方向ATTAGCACCAMP+TTAGCACCCMP+ATTAGCAC亚基与模板的结合亚基形成一个围绕DNA的环状钳polⅠ单一肽链可被某些蛋白酶水解为两个片段大片段称为Klenowfragment常用的工具酶323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604个氨基酸DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ•Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。原核生物中的三种DNA聚合酶polⅠpolⅡpolⅢ5'→3'聚合酶活性+++5'→3'外切酶活性+--3'→5'外切酶活性+++生理功能去除引物,填补缺口未知DNA复制修复损伤校正错误校正错误真核生物五种polα、polβ、polγ、polδ、polεpolα具有引物酶活性polδ主力Polγ参与线粒体DNA复制Polε损伤修复、校读和填补缺口polβ低保真参与应急修复碱基配对碱基选择及时校读DNA复制的保真性DNA连接酶DNA连接酶(DNAligase)催化DNA片段之间磷酸二酯键形成DNA连接酶催化的条件是：3‘-OH，5’-P未封闭的缺口位于双链DNA中（局部）消耗能量原核生物中由NAD+供能真核生物中由ATP供能。POO-O-OHO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’•DNA连接酶在复制中起接合缺口的作用•在DNA修复、重组及剪接中起同样作用•基因工程的重要工具酶DNA聚合酶、DNA连接酶、拓扑酶都形成磷酸二酯键区别？小结基本特征originsemiconservativesemi-discontinuousPrimer主要酶DnaB，ssb，topoPrimaseDNAPolymeraseⅢδDNAligase一、复制的起始预引发：DnaA+DnaB+DnaC+SSB解旋解链，形成复制叉：组装引发体：引发引物酶合成引物DnaG拓扑酶解旋第三节DNA生物合成过程oriC结构特征含三组串连重复序列富含AT2对反向重复序列两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成复制起始识别区二、复制的延长（一）聚合子代DNA：DNA聚合酶沿模板链3‘→5’方向滑动，在5‘→3’方向聚合子代DNA链（二）引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。三、复制的终止（一）去除引物，填补缺口：DNA聚合酶Ⅰ5‘－3’外切酶活性5’－3’聚合酶活性（二）连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。（三）真核生物端粒的形成：端粒（telomere）真核生物染色体末端的结构通常膨大成粒状富含G、T的短重复序列构成末端由于引物RNA的水解而可能缩短端粒酶端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)端粒酶(telomerase)的作用机制第四节逆转录和其它复制方式自学逆转录病毒逆转录酶cDNA文库其它复制方式滚环复制——噬菌体DNAD环复制——线粒体DNA第五节DNA的损伤与修复DNA损伤——突变mutation突变的意义突变的类型突变的效应损伤修复直接修复取代修复——涉及DNA的合成第五节DNA的损伤与修复DNA一级结构的任何改变称为突变mutation常见形式碱基脱落碱基修饰/去修饰交联链的断裂重组一、突变的意义突变是演化的分子基础横向——自然界生命的多样性纵向——生命的复杂性突变是某些疾病的发病基础二、引起突变的因素自发因素：自发脱碱基：糖苷键的自发断裂，引起碱基脱落自发脱氨基C-UA-H复制错配物理因素：紫外线、电离辐射、X射线X射线和电离辐射常引起DNA链的断裂紫外线常引起嘧啶二聚体的形成TT，TC，CC等二聚体引起复制障碍。化学因素脱氨剂：亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C生成U，A生成H烷基化剂DNA加合剂苯并芘碱基类似物断链剂过氧化物，巯基化合物三、DNA突变的类型点突变转换–––同类型碱基的取代颠换–––不同类型碱基的取代镰形红细胞贫血–β链第6位氨基酸突变–CTC-CAC插入–––增加一碱基对缺失–––减少一碱基对碱基的转换三、DNA突变的类型复突变插入–––增加一段顺序缺失–––减少一段顺序倒位–––一段碱基顺序发生颠倒移位–––一段碱基顺序的位置发生改变重排–––一段碱基顺序与另一段碱基顺序发生交换DNA突变的效应同义突变有时引起翻译效率下降误义突变氨基酸顺序改变无义突变多肽链提前终止移码突变(框移突变)四、DNA损伤的修复DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。光复活直接修复转甲基作用直接连接无差错修复切除修复取代修复重组修复有差错倾向修复SOS修复（一）直接修复：1．光复活：（lightrepairing）：修复嘧啶二聚体的损伤修复过程光复活酶（photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物300～600nm可见光获得能量将嘧啶二聚体的丁酰环打开光复活酶从DNA上解离。2．转甲基作用转甲基酶去除修饰的甲基3．直接连接DNA连接酶（二）取代修复：1．切除修复(excisionrepairing)：广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复核酸内切酶；DNA糖苷酶。切除修复的过程DNA糖苷酶切除碱基形成AP位点无碱基的片断核酸内切酶PolεDNA连接酶着色性干皮病(xerodermapigmentosis，XP)切除修复缺陷性遗传病不能修复紫外线照射引起的DNA损伤，易发生皮肤癌。2．重组修复(recombi