新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法

1第三章分子发光分析法2第一节概述分子发光（molecularluminescence）某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后，返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来的分析方法很为非自发光分析法。M+能量→M＊Mhγ3分类光致发光（PL）生物发光（BL）化学发光（CL）电致发光（EL）分子磷光分子荧光分子发光分析法:根据物质所发射的光谱线的位置及强度进行物质鉴定和含量测定的方法。M+h→M＊Mh’高能态（激发态）Ei低能态（基态）E0吸收发射hh’本章重点掌握分子荧光分析法、化学发光分析法了解生物发光分析和分子磷光分析45第二节分子荧光分析法一、分子荧光和磷光的产生1、电子自旋状态的多重性π*nππ*nππ*nππ*nππ*nπ激发单重态S=0M=2S+1=1单重态SS=0M=2S+1=1π*→nπ*→π三重态TS=1M=2S+1=3总自旋量子数6S2S1S0S2S1S0S2S1S0T2T1S0T2T1S0单重第一激发态S1单重基态S0单重第二激发态S2第一激发三重态T1第二激发三重态T2能量：S2＞T2＞S1＞T1＞S07hγ（荧光）hγ（磷光）几率小（禁阻）10-8s10-4~10s能量：S2＞T2＞S1＞T1＞S082、无辐射跃迁辐射跃迁92）内转换（IC）同一多重态的不同电子能级间振动能级部分重叠，电子由高电子振动能级转移到低电子振动能级的过程。产生时间10-11~10-13s1）振动弛豫（VR）在同一电子能级内，激发态分子通过与周围分子碰撞而将多余能量以热的形式传递给周围分子，自身由高振动能级回到低振动能级的现象。产生时间10-12s10113）系间窜跃(ISC)不同多重态间有振动能级的重叠，分子由激发单重态（S1）跨越到激发三重态(T1)的过程，电子需要自旋反转。所需时间10-6s12133、分子荧光和磷光的产生及类型（1）分子荧光瞬时荧光(快速荧光)分子由第一激发单重态（s1）的最低振动能级→单重基态(s0)所产生的辐射光。为单重态间的跃迁，概率大，过程快10-8s延迟荧光单重基态(s0)分子跃迁至第一激发三重态（T1）碰撞激活第一激发单重态（S1）振动弛豫S1的最低振动能级荧光1415由于振动弛豫和内转换损失部分能量，发射荧光的能量比激发光的能量小，波长要长，这种现象称为斯托克斯位移（Stokesshift）710()sexem11λex—最大激发光波长；λem—最大发射光波长斯托克斯位移越大，激发光对荧光测定的干扰越小16电子改变自旋，且在亚稳态T1停留较长时间以及分子碰撞能量损耗大。磷光能量更低，波长更长。发光速度很慢：10-4～10s（2）分子磷光单重基态(s0)受激分子降至S1最低振动能级T1系间窜跃T1的最低振动能级磷光振动弛豫17200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱18二、分子荧光的性质1、荧光激发光谱19（1）激发光谱的绘制固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度的变化。Fλ—纵坐标，λex(激发波长)—横坐标第一单色器或滤光片记录仪第二单色器或滤光片荧光光源激发样品池Fλex固定em荧光波长20（2）激发光谱的特点a.不论第二单色器选择何处作为固定测定波长，不影响谱线的形状b.激发光谱与该物质的吸收光谱非常近似，同一物质最大激发波长与最大吸收波长一致。212、荧光发射光谱（荧光光谱）（1）荧光光谱的测绘固定第一单色器，保持激发光的波长和强度，改变第二单色器，测定发射的荧光在各个波长下的相对强度，记录荧光强度（F）对发射波长（λem）的关系曲线第一单色器或滤光片记录仪第二单色器或滤光片荧光光源激发样品池Fem固定ex激发光波长22（2）荧光光谱的特性a.发射光谱的形状与激发波长无关分子无论被激发到哪一个激发态，最终均回到第一激发单重态的最低振动能级再回到基态，产生分子荧光。b.荧光光谱与吸收光谱有镜像关系荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；23镜像关系?S04321S1432120025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800IFex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)1→41→31→21→11→11→21→31→424f发射荧光的光子数吸收激发光的光子数三、分子荧光的参数1.荧光寿命τ处于激发态的荧光体返回基态前停留在激发态的平均时间，处于激发态的分子数目衰减到原来的1/e所需要的时间2.荧光量子产率fffKKK0＜Фf＜125四、荧光强度的主要影响因素1.荧光强度与浓度荧光体浓度很稀0fKIbKfIcK荧光分析适用于微量组分或痕量组分分析261）共轭π键体系跃迁类型：π*→π的荧光效率高，提高共轭度有利于增加荧光效率，环越大，红移程度越大，发光越强2.荧光与分子结构272）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。无荧光发荧光283）取代基效应给电子取代基-OH,-CN，-NH2等，可扩大共轭双键体系加强荧光得电子取代基=C=O,-NO2-COOH，-SH等减弱荧光，加强磷光。重原子效应：芳环上取代F、Cl、Br、I之后，系间窜跃加强，荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光则增强。取代基的位置：邻、对位荧光增强，间位抑制294）电子跃迁类型n→π*系间窜跃强烈，荧光很弱π→π*，易发生，ε大，荧光强303.荧光猝灭定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度减弱的现象。使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。分为静态猝灭动态猝灭M+Q→MQ（非荧光性物质）(基态)（猝灭剂）λexMM*+QMQ*MQ31主要类型1）自猝灭M*+M→Mn2）电荷转移猝灭M（甲基蓝）M*M+λem（荧光）λexM*+Fe2+M-+Fe3+I-＞CNS-＞Br-＞Cl-＞C2O42-＞SO42-＞NO3-＞F-猝灭的强弱顺序323）转入三重态的淬灭含溴化物、碘化物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物及某些杂环化合物容易转变为三重态，因而易使荧光淬灭,氧的存在会增强系间窜跃。S1T14）光化学反应某些光敏物质吸收光辐射后，发生了化学反应或预离解335、表面活性剂的影响当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度，会缔合为球状胶束，对荧光物质起到保护作用4、温度、酸度和溶剂的影响34特点1.灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；检测下限：10-10~10-12g/ml2.选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；3.试样量少缺点：应用范围小。五、荧光定量分析方法35定量依据与方法定量依据fIKc方法工作曲线法比较法荧光猝灭法01[]ffIKQI多组分混合物荧光分析00fxfxsfsfIIccIIa无相互干扰，分别测定b有干扰，同紫外－可见吸收光谱定量方法解联立方程组法等吸收双波长消去法36荧光分析注意事项a.防止荧光污染器皿、溶剂、洗涤剂、滤纸、润滑油等b.防止散射光的干扰丁铎尔散射光、瑞利散射光、拉曼散射光的干扰可通过选择合适的测定波长，滤光片等手段加以消除37六、荧光分光光度计国产970CRT型381.仪器主要部件：激发光源、双单色器系统、样品池、检测器特殊点：有激发和发射两个单色器，光源与检测器通常成直角。光源：氙灯（250~800nm）单色器：选择激发光波长的第一单色器选择发射光(测量)波长的第二单色器；样品池：石英比色皿(四面透光)检测器：光电倍增管。39402.仪器的灵敏度规定：在特定条件下能检出0.05mol/LH2SO4介质中硫酸奎宁的最低浓度为灵敏度。灵敏度：10-10~10-12g/mLfSa绝对灵敏度41第三节分子磷光分析法磷光现象：T1S0主要有：低温磷光分析、室温磷光分析42一、低温磷光分析试样溶于有机溶剂刚性玻璃状物测磷光77K（液氮）防止分子间碰撞溶剂条件：①易于制备、提纯②溶解能力强（很好的溶解分析物）③在77K下有足够黏度并能形成刚性玻璃体④背景低，在所研究的光谱区无明显吸收，发射43二、室温磷光分析将试样固定在滤纸、硅胶、Al2O3、玻璃纤维、淀粉KBr等基体上，以增加其刚性，减少三重态碰撞猝灭，增加强度。胶束稳定的溶液室温磷光分析（MS-RTP）环糊精室温磷光（CD-RTP）44第四节化学发光分析法化学发光(CL)：由化学反应的能量把分子激发,从激发态返回到基态，产生光辐射的现象。化学发光分析法：依据待测物浓度与体系的化学发光强度的关系，确定待测物含量的一种痕量分析方法。特点：灵敏度高、线性范围宽、设备简单、分析速度快易实现自动化45一、化学发光分析的基本原理1、化学发光反应的基本条件发光反应必须满足以下条件a.化学反应必须产生足够的化学能，且被发光物质吸收形成电子激发态。在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ·mol-1激发能。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。b.处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态462.化学发光效率化学发光效率CL激发态分子数发射的光子数参加反应的分子数激发态分子数参加反应的分子数发射的光子数emCeCL激发态分子的产率激发态分子的发光效率大于0.001%的发光反应称为强化学发光1.0×10-6%～1.0×10-3%为弱化学发光小于1.0×10-6%为超微弱化学发光473.化学发光强度与反应物浓度的关系化学发光强度ICL取决于化学发光反应的转化速率发光效率与单位时间反应物浓度变化的乘积CLCLCLdcIdtdtcdt发光总强度恒定，发光总强度与被测物浓度c成正比()CLCLdcItdtCL484.灵敏度和检测限灵敏度：取决于环境污染，干扰及排除检出限03SDLmS0—空白信号标准差m—被测物工作曲线斜率仪器越稳定S0↓φCl越高m↑DL↓49二、化学发光分析的类型1.液相化学发光鲁米诺（Luminol）光泽精过氧草酸盐没食子酸、洛粉碱等。501）鲁米诺体系（3–氨基苯二甲酰环肼）425nm鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定Cl2、H2O2、O2和NO2，也可测催化金属离子。化学发光效率为1%51⊕⊕+H2O2+2+hν（λmax=470mm）（N-甲基吖啶酮）催化剂OH-2)光泽精体系N，N-二甲基-9，9-联吖啶二硝酸盐52可测Fe2+,Fe3+，Cr3+,Mn2+，Ag+，Pb2+,Bi3+等可测丙酮、羟胺、果糖、Vc、尿素、肌酸酶等可作为化学发光探针，测全血中吞噬细胞的活性53+fluorophorfluorophor*荧光体fluorophor+hν+2CO2常用的双（2，4，6-三氯苯基）草酸酯TCPO双（2，4-二硝基苯）草酸酯DNPO3)过氧草酰体系可测甲醛、甲酸、葡萄糖、氨基酸等54552、气相化学发光常温下气体:O3、NO、NO2、SO2、H2S、C2H4等火焰中化学发光NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h（＞600nm）灵敏度1ng/mlSO2+O+O→SO2*+O2SO2*→SO2*+h(280nm)灵敏度0.001μg/ml；S+S→2S2*S2*→S2+h（394nm）NO+H→HNO*→HNO+h（690nm）56三、化学发光分析仪器1、分立取样式液相化学发光仪静态测定特点设备简单、便宜可记录化学反应全过程速度慢、精密度差57三、化学发光分析仪器2、流动注射化学发光仪动态测量特点自动化、精密度高、分析速度快适于批量测定流动注射化学发光仪器581.溶液酸度：影响存在形态，发生副反应2.试液的注入速率：速率越大，发光强度变化越大3.共存干扰物：引起