天然食品防腐剂乳酸链球菌素

天然食品防腐剂——乳酸链球菌素©2009-3-23国家食物与营养咨询委员会缪存影（浙江师范大学化学与生命科学学院，金华321004）摘要：本文介绍了乳酸链球菌素的理化性质、抗菌机理、安全性及检测方法的研究进展，综述了乳酸链球菌素在食品工业中的应用现状。关键词：食品防腐剂；乳酸链球菌素；抗菌机理；检测方法；应用防腐剂作为食品保鲜和贮藏的重要食品添加剂，其安全性日益受到食品加工行业的关注与重视。在食品加工中采用纯天然的食品防腐剂、保鲜剂，生产出满足消费者需求的绿色食品，这将是防腐剂研究开发领域的重点。乳酸链球菌素（Nisin）是一种乳酸菌代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代谢产物，被认为是一种高效、天然、绿色食品防腐剂。1乳酸链球菌素的研究开发动态早在1928年，美国学者Rogers和Whitter首先发现乳酸链球菌的代谢产物能抑制乳酸杆菌的生长；1933年，Whitehead及其合作者观察到，野生乳酸链球菌能抑制干酪制作中乳酸菌的生长和酸的产生，并发现抑制乳酸菌生长的乳酸链球菌代谢产物实质上是一种多肽，并分离出这种物质；1947年，Mattick和Hirsch研究发现血清学N群中的一些乳酸链球菌产生具有蛋白质性质的抑制物，证明该物质可抑制许多革兰氏阳性菌，并将其命名为“NISIN”，取自“Ninhibitorvsubstance”。1953年乳酸链球菌素的第一批商业产品——Nisaplin在英国面市，Nisin作为商品进入市场；1969年联合国粮农组织和世界卫生组织（FAO／WHO）食品添加剂联合专家委员会确认Nisin可作为食品添加剂；1971年，Gross和Morell阐明了Nisin分子的完整结构；1988年，Buchman等克隆了编码Nisin前体的结构基因并测定了DNA序列；1991年，Mulders等发现Nisin有2个天然变异体——NisinA和NisinZ。我国于1990年开始批准使用Nisin。到目前为止，全世界约有50多个国家和地区广泛使用Nisin，英国已有40多年的应用历史，并实现了工业化生产。2乳酸链球菌素的性质2.1乳酸链球菌素的理化性质乳酸链球菌素是一种高分子多肽，它的分子式为C143H228N42O37S7，由34个氨基酸组成，其氨基末端为异亮氨酸，羧基末端为赖氨酸，分子量为3510Da。一些研究表明，乳酸链菌素活性形式经常出现二聚体和四聚体，相对分子量分别为7000Da和14000Da。Nisin在天然状态下主要有两种形式，分别为NisinA和NisinZ。Nisin的溶解性、稳定性都与溶液的pH值密切相关。Nisin的溶解度随pH值的下降而提高，pH值2.5时溶解度为12％，pH值为5.0时下降到4％，在中性及碱性条件下几乎不溶解。实验结果表明，Nisin在酸性条件下极为稳定，pH为2.0条件下可耐受高温处理（12l℃，15min），无活力损失，而在中性或碱性条件下即发生失活。2.2乳酸链球菌素的抑菌特质与机理乳酸链球菌素能有效地杀死或抑制引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌，特别是细菌孢子。如葡萄球菌、链球菌、乳杆菌、小球菌、明串珠菌、芽抱杆菌等均对乳酸链球菌素很敏感。通常细胞孢子耐热性很强，一般杀菌条件难以将其杀灭，如鲜乳135℃，2s超高温瞬时灭菌，芽孢死亡率为90％，若同样条件下再添加2.0～4.0IU／mlNisin，则芽孢死亡率100％［1］。而对革兰氏阴性菌、酵母和霉菌均无作用，但在一定条件下，如冷冻、加热、降低pH值EDTA处理等，乳酸链球菌素亦可抑制一些革兰阴性菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等的生长。目前人们普遍认为Nisin的抑菌机理类似于阳离子表面活性剂，其抑菌作用主要是杀菌，而非抑菌或溶菌，细胞膜是其作用位点，它抑制了细胞壁中肽聚糖的生物合成，从而使细胞壁质膜与磷脂化合物合成受阻，并引起细胞内含物和三磷酸腺苷等外泄，甚至导致细胞裂解。2.3乳酸链球菌素的安全性英国Aplin公司从251份牛奶样品中检测到其中的109份样品含有可产生Nisin的乳酸链球菌，说明Nisin天然存在于人们日常饮用的牛奶中。乳酸链球菌素是多肽，食用后在消化道中很快被蛋白酶水解成氨基酸，不会引起常用其他抗菌素出现的抗药性，也不会改变人体肠道内的正常菌群。病理学研究以及毒理学试验证明，Nisin对人体安全无毒。3乳酸链球菌素的检测方法Nisin定量分析的最初测定的方法为1934年CoxGA等人建议采用的甲基蓝还原法，后来相继开发了用于Nisin定量的生物分析方法，包括试管稀释法（TubeDilution）、浊度分析法（TurbidityAssays）、琼脂扩散法（AgarDiffusionTest）、ATP生物发光测定法（ATPBioluminometry）、绿色荧光蛋白测定法（GFPbioassay）和微量滴定法（Microtitration）等。3.1琼脂扩散法Nisin定量的生物分析法中最普遍是琼脂扩散法（ADT），尤其适用于那些高度不透明的、不能用浊度分析法分析的样品。WolfandGibbons（1996）改进了琼脂扩散法，提高了灵敏度、准确性。琼脂扩散法的原理是在琼脂表面利用检测菌的生长显示抑菌效果，为消除干扰因素的影响，常使用Nisin标准液和未知样液在同一平板扩散，并由他们的抑菌圈直径及标准效价换算出效价。由于Nisin的扩散性能差，故常在检测培养基中加入1％Tween以促进Nisin在琼脂中扩散。目前测定常用的指示菌种为溶壁小球菌、金黄色葡萄球菌和滕黄微球菌，菌悬液的浓度约为107cfu／ml。3.2免疫测定法生物分析的重要性不可否认，但费时，受低特效性、低灵敏度和源于食品提取液和发酵液相互干扰等因素的制约，借助于免疫方法的迅速、直接和灵敏的技术，现已经开发出定量检测Nisin的免疫技术。Bouksaim报道了采用NisinZ多克隆抗体（pAb）的ELISA法，检测出NisinZ的极限分别为：0.23nmol／L（缓冲液）、0.5nmol／L（牛奶）、1.49μmol／L（复合培养基）；Falahee报道了采用羊多克隆抗体的夹心式（Sandwich）酶联免疫吸附分析法测定NisinA的方法，获得更高的灵敏度，最低检测极限为0.15nmol／L（纯溶液）和69nmol／L（奶酪）。Nandakumar将流动注射系统（FIA）和ELISA进行组合来测定Nisin，开发出一种采用单克隆抗体的连续的竞争流动注射免疫分析系统（Competitive-Flow-InjectionImmunoassaySystem），这个Flow-ELISA系统基于通过缓流载带反应物到固定在填充柱担体中的抗体上，并通过一个膨胀床系统可以免去繁琐耗时的净化等前处理，可以用于直接测定悬浮液中的Nisin而不会有显著干扰，从而实现了在线检测发酵过程中的Nisin或者食品体系中的Nisin，该体系的响应域值为690μmol／L。4乳酸链球菌素作为食品防腐剂的优缺点乳酸链球菌素是一种多肽，人体食入后可被胃蛋白酶迅速分解为氨基酸，被人体吸收，不会改变人体肠道内正常菌群的存活，亦不会象抗生素一样产生交叉抗性。乳酸链球菌素作为防腐剂添加于食品中，不会对食品的色、香、味、口感产生副作用。乳酸链球菌素的使用可降低食品的杀菌温度、减少热处理时间，从而保持食品的良好风味和营养价值，并节省能源，提高工作效率。乳酸链球菌素的酸热稳定性和低温贮藏稳定性，有利于持久发挥其防腐效果，延长食品的保质期和货架期。乳酸链球菌素与热处理杀菌相结合，可大大提高腐败菌对热的敏感性，尤其是芽抱。然而，作为食品防腐、保鲜剂的乳酸链球菌素存在着抗菌谱窄、只对G＋菌有作用，对G－致病菌、酵母、霉菌及病毒无效等缺点。5乳酸链球菌素在食品工业中的应用乳酸链球菌素作为一种天然、无毒的防腐剂，在食品工业中的应用相当广泛，如乳制品、肉制品、酿酒、果汁饮料、焙烤食品等。5.1在乳制品中的应用乳制品营养丰富，极易腐败变质，经巴氏灭菌和冷藏可延长保存期，但其中肉毒梭状芽孢杆菌仍能存活，并产生一定毒素。Nisin可用于巴氏灭菌牛奶，现已成功地应用于全脂消毒牛乳、灭菌乳、风味乳、淡炼乳、再制乳等各种乳制品的防腐和保鲜，添加30～50IU／ml的乳酸链球菌素可使鲜奶的货架期延长1倍。5.2在肉制品中的应用乳酸链球菌素可用于火腿、鱼类等高蛋白食品，明显改善其质地、外观，延长保存期，并可取代或降低亚硝酸盐的用量。研究表明，75mg／L乳酸链球菌素即可起到150mg／L亚硝酸盐的防腐效果。5.3在罐头制品中的应用Nisin在酸性条件下易溶、稳定，抑菌活力也高，因此可用于高酸性（pH4.6）罐头的保鲜，可以很好地保持内容物的营养价值和良好感观（色、香、味、形、质地等）。现已广泛应用于西红柿、马铃薯、蘑菇、水果等罐头中。5.4在酱菜中的应用瓶装酱菜是可供长期贮存的方便食品。目前，各类酱菜中含盐量偏高，约在10%～20％之间，但高盐食品易诱发高血压等疾病。加入100mg／kgNisin，可抑制杂菌生长，并使盐的浓度下降。由于一些国家在食品中不准使用苯甲酸钠，所以Nisin用于瓶装酱菜出口，具有现实意义。5.5在酿造工业中的应用将乳酸链球菌素添加到发酵罐中防止和控制污染、延长非巴氏灭菌或生啤的货架期，如啤酒发酵过程中即使加入1000IU／ml的乳酸链球菌素也不会影响啤酒酵母的生长和旺盛发酵，而杂菌却得到有效抑制。随着人们生活水平的提高，健康食品、绿色食品的概念越来越被人们接受，对高效、无毒的天然防腐剂的研究和应用也越来越引起人们的重视。Nisin作为一种高效、无毒的天然食品添加剂符合未来食品防腐剂的要求，不仅有较好的防腐抑菌作用，而且能减弱热处理强度，降低加工成本，改善食品风味、外观和营养价值。◇参考文献［1］张玉华，孟一.天然食品防腐剂——Nisin的应用.食品研究与开发，2003，24（2）：109-110.［2］陈秀珠，张振中，贾士芳.乳链菌肽的生物合成及其分子结构与功能的关系.微生物学报，2002，42：628-633.［3］GireeshT，etal.BiosynthesisoftheLantibioticNisin:GenomicOrganizationandMembraneLocalizationoftheNisBProtein.ApplEnvironMicrobiol，1998，58：1670.［4］江芸，周光宏，高峰，等.国产Nisin部分特性的研究.食品科学，2001，22（4）：18-21.［5］李红，赵春燕.乳酸链球菌素的研究进展.食品科技，2006，1：75-78.［6］陈秀珠，何松，龙力红，等.微生物学通报.1995，22（4）：215-218.［7］李科德，韩木兰，柏建玲.乳酸链球菌素的研究和应用.微生物学通报，2002，29（4）：102-104.［8］LaridiR，KheadrEE，BenechR_O，etal.LiposomeencapsulatedNisinZ：optimization，stabilityandreleaseduringmilkfermentation，InternationalDairyJounal，2003，13：325-336.［9］李增利.Nisin的生产、提纯和检测.中国食品添加剂，2004，4：64-68.［10］NandakumarR，NandakumarMP，MattiassonB.QuantificationofNisininflow_injectionimmunoassaysystems，Biosensors&Bioelectronics2000，15:241-247.［11］DaoudiL，TurcotteC，LacroixC，etal.Productionandcharacterizationofanti_NisinZmonoclonalantibodies:suitabilityfordistinguishingactivefrominactiveformsthrough