电针对COH小鼠子宫内膜IGF1的影响朱书秀王芳

电针对COH小鼠子宫内膜IGF-1的影响朱书秀王芳（江汉大学医学院中医系，湖北武汉，430065）体外受精-胚胎移植（invitrofertilization-embryotransplantation，IVF-ET）是目前治疗不孕不育症最有效的方法，随着控制性超排卵（controlledovarianhyperstimulation,COH）方案的不断完善，临床受精率已达75%-90%，但临床妊娠率却徘徊在20%-30%水平[1]。针刺疗法与IVF-ET技术相结合，可有效提高临床妊娠率，综合其作用机制为：（1）改善卵巢功能，提高卵母细胞质量，促进卵泡发育成熟[2-4]（2）改善子宫内膜容受性[5、6]；（3）缓解紧张、焦虑等不良情绪[7、8]。近年来研究表明，人类子宫内膜具有完整的胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactor，IGF）系统[9]，在局部可通过自分泌/旁分泌发挥作用，直接或间接地参与子宫内膜蜕膜化、胚胎着床及胚胎发育[10]。那么，针刺改善临床妊娠率是否由IGF-1所介导呢？为回答此问题，我们观察了电针对COH小鼠子宫内膜IGF-1及其mRNA表达的影响，探讨电针提高临床妊娠率的可能机制。1.材料与方法1.1实验动物SPF级昆明纯种性成熟小鼠，雌性鼠8周龄，体重30~35克；雄性10周龄，体重35~40克，用于交配，由武汉生物制品研究所有限责任公司提供[SCXK（鄂）2012-0003]。适应性喂养1周后，所有雌性小鼠进行阴道涂片观察动情周期，动情周期正常者纳入本实验。饲养条件为自由摄食、饮水，环境温度18~22℃，相对湿度60~80％。1.2药品与试剂曲普瑞林（法国益普生生物制药有限公司），孕马血清促性腺激素（宁波三生药业有限公司），绒促性素（HCG，丽珠集团丽珠制药厂），KSOM培养液（美国CaissonLabs，2570292），M2培养液（中科迈晨（北京）科技的限公司，E12UE050），Trizol（Invitrogen，15596-018），cDNA第一链合成试剂盒（Fermentas，#K1622），β-actin抗体（武汉博士德生物工程有限公司，BM0627），IGF-1抗体（Arigobio，ARG20317）。1.3主要实验仪器体视显微镜（日本尼康，SMZ800N），倒置显微镜（日本奥林巴斯，CKX31），二氧化基金来源：国家自然科学基金资助项目（81373725）碳培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司，WJ-160A-Ⅱ），PCR仪（东胜创新生物科技有限公司，EDC-810），水平电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司，JY300）。1.4实验方法（1）模型制备依据文献[11]，于每日上午腹腔内注射阿拉瑞林40μg/100g体重，连续9天，进行降调节；至第9天同时注射孕马血清促性腺激素40IU/l00g体重，1次，进行Gn启动；48小时后注射绒促性素（HCG）100IU/l00g体重。（2）动物分组COH造模后，随机分为COH组、电针组，每组又分为供体鼠（提供胚胎）和受体鼠（接受移植胚胎，亦称假孕鼠）。另设自然周期组，亦分为供体鼠和受体鼠，每组供体鼠和受体鼠各10只。（3）处理方法①雄性结扎鼠的制备：纵形切开阴囊处皮肤及包膜，分离暴露双侧输精管，切断结扎。1周后，与雌性小鼠合笼，无妊娠，证实输精管结扎成功。②胚胎获取及胚胎培养：注射HCG后供体鼠与雄性鼠按雌：雄=1：1合笼，次晨8时检查阴栓，于孕第二天下午14时打开腹腔，获取受精卵，培养箱中培养。③受体鼠（假孕鼠）的准备：与供体鼠同步，受体鼠与雄性结扎鼠1：1合笼，次晨检查阴栓，见阴栓者为假孕小鼠，逐一标记见栓日期。④胚胎移植：于胚胎培养第68小时，将供体鼠的胚胎移植至本组同日见阴栓的受体鼠内，每侧子宫种植胚胎8个。⑤电针治疗：电针组（供体鼠和受体鼠）于HCG注射日行电针治疗，至取材停止针刺，1次/日。取“关元”、“中极”、“三阴交”，采用φ0.16×7mm美容针灸针，进针2mm，关元、中极接韩氏电针仪（HANS-100A），连续波，频率2Hz，强度1mA，留针20min。自然周期组和COH组（包括供体鼠和受体鼠）不行电针治疗。（4）胚胎种植的观察和计数于种植后第6天向小鼠尾静脉注射0.3ml0.5%台盼兰，5min后脱臼法处死小鼠，75%酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔，暴露双侧子宫，被台盼兰染为蓝色部位为小鼠胚胎着床位点，计数妊娠小鼠及着床位点数，计算各组小鼠妊娠率（孕鼠数/总动物数）和平均着床位点数（各组总着床位点数/各组孕鼠数）。（5）子宫内膜IGF-1蛋白检测提取组织总蛋白80μg，蛋白变性后SDS-PAGE电泳、转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉的TBST室温摇床封闭2h，加入IGF-1抗体（1:500），4℃孵育过夜，加HRP标记二抗（1:50000）室温摇床孵育2h，应用Bio-Rad图像分析系统对目的条带进行光密度扫描，IGF-1蛋白相对量=IGF-1蛋白产物条带密度/β-actin蛋白产物条带密度。（6）统计学处理使用SPSS19.0软件包分析数据。计量资料以x±s表示，多组组间比较采用方差分析；计数资料采用χ2检验，总体比较以P0.05为差异有统计学意义2.结果2.1各组小鼠妊娠率及平均着床位点数各组小鼠妊娠率及平均着床位点数如表1、图1，经控制性长超排后，COH组妊娠率和平均着床位点数显著低于自然周期组，具有统计学意义（P＜0.01）；在HCG注射日行电针治疗后，妊娠率和平均着床位点数较COH组显著提高，且差异具有统计学意义（P＜0.01），但平均着床位点数仍显著低于自然周期组。表1各组小鼠妊娠率及平均着床位点数（x±s）组别n妊娠率（%）平均着床位点数自然周期组101001）11.3±2.831）COH组10705.43±2.3电针组101002）9.5±2.682）注：与自然周期组比较，1）P＜0.01；与COH组比较，2）P＜0.01图1：各组小鼠胚胎种植后第6天子宫胚泡实物图注：A：自然周期组；B：COH组；C：电针组2.2各组小鼠子宫内膜IGF-1蛋白各组小鼠子宫内膜IGF-1蛋白及其mRNA表达如表2、图2。模型制备后，COH组子宫内膜IGF-1蛋白及其mRNA表达显著性减少，与自然周期组相比，具有统计学意义P＜0.01）；电针治疗后表达增加，与COH组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。表2各组小鼠子宫内膜IGF-1及其mRNA表达（x±s）组别nIGF-1蛋白自然周期组100.509±0.041）COH组100.207±0.082电针组100.675±0.0822）注：与自然周期组比较，1）P＜0.01；与COH组比较，2）P＜0.01图2各组小鼠子宫内膜IGF-1蛋白Westernblot图（左图为β-actin）注：A：自然周期组；B：COH组；C：电针组3.讨论胚胎种植发生在受精后3-5d，胚胎穿过宫腔上皮，侵入子宫内膜间质、腺体和血管，这一过程包括定位、黏附、穿透3个阶段，需要滋养层细胞具有特殊的侵袭能力，目前认为滋养层穿透埋入子宫内膜的最佳深度由多因素决定：包括甾体激素、细胞因子、生长因子、黏附分子等，尤其是局部自分泌、旁分泌因子对滋养层的增殖、迁移和侵袭的重要作用。子宫内膜有完整的胰岛素样生长因子[9]，IGF-1是胰岛素样生长因子系统的主要组成成员之一。研究表明[12]，IGF-1可通过介导雌、孕激素的作用对子宫内膜的生长和分化进行调节，从而进一步调控胚泡植入，而且IGF-I分泌改变可以影响胚胎种植过程中子宫内膜的形态及分子学状态[13-14]，有研究发现[15]着床前胚胎不表达IGF-1，在胚胎着床的早期，宫腔内IGF-1表达逐渐增加，提示IGF-1在胚胎着床过程式中发挥着重要作用。COH是IVF-ET的重要步骤，使用大量的外源性促性腺激素，在可控制的范围内诱发多个卵泡发育成熟，但大量激素的应用，影响了子宫内膜环境，从而导致妊娠率低下。中医学认为：超排卵是由于短时间内天癸大量泌至所致，必将耗损肾精，是一种人为的相对虚损状态。采用“关元”、“中极”、“三阴交”治疗，可达补肾精、调冲任、温胞宫之功。在本实验中，我们运用控制性超促排长方案建立控制性超排卵小鼠动物模型，研究控制性超排卵后子宫内膜IGF-1及妊娠率的变化，并观察针刺对表达的影响。研究结果显示超排卵后妊娠率、平均着床位点数降低，且IGF-1表达也减少，说明超排卵后妊娠率低下可能与IGF-1有关。经电针治疗后，子宫内膜IGF-1表达增加，从而提高小鼠临床妊率和平均着床位点数。本研究通过观察电针对子宫内膜IGF-1表达的变化，初步证实了电针结合IVF-ET提高妊娠率的可能机制，但电针是如何改善IGF-1的表达，还需进一步深入研究。ABC参考文献：[1]曹泽毅.妇产科学[M].第1版,北京:人民卫生出版社,2008:595.[2]高奉,王志慧,胡胜利.针药并用治疗卵巢功能早衰60例[J].上海针灸杂志,2014,33(2):168-169.[3]王红峰,王小红.左归饮合二至丸加减配合针刺治疗卵巢储备功能下降60例[J].山东中医杂志,2014,33(11):894-896.[4]LiJing,CuiWei,SunWei,etal.Effectofelectroacupunctureoneggqualityandtumornecrosisfactor-αofpatientswithpolycysticovariansyndrome[J].WJAM,2014,24(3):9-15.[5]高伟娜,唐潇,呙月,等.针刺对胚胎着床障碍大鼠子宫内膜CCR2的影响[J].中西医结合研究,2013,5(4):176-180.[6]朱书秀,刘杰,张英.针刺对超排卵小鼠子宫内膜形态学的影响[J].江汉大学学报(自然科学版),2012,40(6):56-57.[7]陈前琼,魏清琳,敬思猛,等.电针改善取卵术中术后不适症状的研究[J].上海针灸杂志,2014,33(8):730-733.[8]SmithCA,UssherJM,PerzJ,etal.Theeffectofacupunctureonpsychosocialoutcomesforwomenexperiencinginfertility:apilotrandomizedcontrolledtrial[J].JAlternComplementMed,2011,17(10):923-930.[9]RoyRN,GerulathAH,CecuttiA,eta1.Effectoftamoxifentreatmentontheendometrialexpressionofhumaninsulin-likegrowthfactorsandtheirreceptormRNAs[J].MolCellEndocrinol,2000,165(1-2):173-178.[10]李尚为,李蕾,马谊,等.孕激素及胰岛素样生长因子对体外培养的人早孕蜕膜基质细胞增殖活性的影响[J].四川大学学报(医学版),2009;40(3):442-444.[11]王振迎,陈晓勇,陈瑾,等.寿胎丸加减方对超排卵小鼠种植窗期子宫内膜整合素β3蛋白表达的影响[J].南昌大学学报(医学版),2010,50(3):33-36[12]SchamsD,BerishaB,KoernannM,etal.ExpressionandlocalizationofIGFfamilymembersinbovineantralfollidesduringfinalgrowthandinlutealtissueduringdifferentstagesofestrouscycleandpregnancy[J].DomestAnimEndocrinol,2002,22(1)151-72.[13]Kabir-SalmaniM,ShiokawaS,AkimotoY,eta1.Theroleofα5βl-integrinintheIGF-Iind