论文董燕青藤碱对LPS刺激的小鼠及RAW2647细胞A2AP2X7表达的影响

青藤碱对LPS刺激的小鼠及RAW264.7细胞A2A、P2X7表达的影响李景1，吴阳阳，周海松，朱瑞丽，易浪，董燕*，王培训（1.广州中医药大学临床药理研究所免疫研究室，广州510405）[摘要]目的探讨青藤碱(sinomenine，Sin)对LPS刺激的小鼠内毒素血症模型及巨噬细胞RAW264.7细胞炎症模型嘌呤受体A2A、P2X7表达的影响。方法BALB/c小鼠设空白对照组、模型组、青藤碱组（40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg），青藤碱组给予腹腔注射青藤碱30min后，模型组和青藤碱组给予腹腔注射LPS（15mg/kg）建立内毒素血症小鼠模型，ELISA法检测小鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平；RT-PCR检测肝脏、脾脏嘌呤受体A2A，P2X7的表达。RAW264.7细胞设空白组、LPS组、青藤碱组，青藤碱组给予青藤碱（300μmol/L）干预2h之后，LPS组和青藤碱组均给予LPS（100ng/mL），继续培养8h后，ELISA法检测上清TNF-α分泌量，RT-PCR检测细胞P2X7、A2A的mRNA表达。结果LPS刺激下小鼠血清TNF-α和IL-6水平均上升，肝脏、脾脏组织中嘌呤受体A2A、P2X7的表达均升高，青藤碱能下调TNF-α和IL-6水平，并抑制A2A、P2X7的表达；体外LPS刺激下，RAW264.7细胞分泌TNF-α增加，A2A、P2X7的表达增加，青藤碱抑制TNF-α的分泌，并下调P2X7的表达，但对A2A的表达有促进作用。结论青藤碱对LPS刺激的小鼠肝脏、脾脏及体外巨噬细胞中嘌呤受体P2X7的表达增加均表现抑制作用，而对不同组织细胞中A2A表达的影响不同，相关机制有待深入。[关键词]青藤碱；嘌呤受体；脂多糖；细胞因子青藤碱(sinomenine，Sin)是中药青风藤的主要活性成分，有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、镇静等多种药理作用[1]。临床多用其盐酸盐制剂，用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)等免疫性疾病疗效较好，副作用小。也有研究报道青藤碱对LPS诱导的肝炎和急性肺损伤动物模型有干预和保护作用[2]。嘌呤受体参与调控机体的免疫应答，其组织分布广泛，其中又以免疫系统表达最为丰富，发挥重要的免疫调节作用，嘌呤受体A2A、P2X7与炎症反应密切相关。青藤碱发挥抗炎作用是否影响嘌呤受体及其内在机制尚不清楚。本实验通过检测LPS刺激的内毒素血症小鼠和巨噬细胞炎症模型的炎性因子及嘌呤受体A2A、P2X7的mRNA表达变化，观察青藤碱的抗炎作用及对A2A、P2X7表达的影响，为进一步研究青藤碱的抗炎机制打下基础。1材料与方法[第一作者]李景，在读硕士生，从事中药免疫药理研究，Tel:[phone],E-mail:[e-mail][通讯作者]*董燕，博士，研究员，博士生导师，从事中药免疫药理研究，Tel:[phone],E-mail:[e-mail]1.1实验动物及细胞株健康SPF级BALB/c小鼠，雄性，体重20±2g，购于广东省动物中心，合格证号：SCXK(粤）2014-0035。RAW264.7细胞株小鼠巨噬细胞株，引自武汉大学保藏中心。1.2主要药物、试剂与仪器LPS（美国Sigma公司）；青藤碱（分析标准品，HPLC≥97％，美国Aladdin公司）；盐酸青藤碱（Melonepharma大连美仑生物公司）；完全培养液RPMI1640（美国GIBCO）；胎牛血清(FBS)（HYCLOME公司）；青霉素（美国Sigma公司）；链霉素（NEUPROBE公司）；ELISA检测试剂盒（Ebioscience产品）；Trizol（Invitrogen产品）；琼脂糖（BiowestRegularAGAROSEG-10，西班牙）；逆转录试剂盒（Invitrogen产品）；PCR试剂盒（MolecularBiology产品）；A2A、P2X7及内参基因β-actin引物均由生工生物工程公司合成。全自动数码凝胶图像分析系统（Tanon1600，中国上海）；多功能酶标仪（BioTekSynergyHT，美国）；高速冷冻离心机（Eppendorf5810R，德国）；紫外-可见分光光度计（BeckmanDu730，美国）；电泳仪（BIO-RAD，美国）。1.3动物分组、造模及给药BALB/c小鼠30只，随机分为3组：空白对照组（10只）、模型组（10只）、青藤碱40mg/kg组（10只）、青藤碱80mg/kg组（5只）、青藤碱160mg/kg组（5只），编1～10或1～5号。模型组一次性腹腔注射LPS（15mg/kg），青藤碱组于注射LPS前30min腹腔注射不同剂量青藤碱，空白对照组腹腔注射等量PBS。1.4动物标本采集及指标检测小鼠摘眼球采血0.5ml左右，LPS刺激1h时各组1～5号采血用于检测TNF-α，3h时6～10号采血用于检测IL-6，采血后室温静置1h，离心（4℃，900rpm，15min）取上清，用于ELISA检测。6～10号取血后，脱颈椎处死小鼠，摘取肝脏、脾脏置于﹣70℃冰箱保存，用于RT-PCR检测。1.5细胞培养及给药RAW264.7细胞采用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，调整细胞浓度为1×105·mL-1，每孔加1mL入24孔板，设空白组、LPS组、青藤碱300μmol/L组，每组3个复孔。37℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜后换新的RPMI1640液1mL，青藤碱组加含青藤碱（300μmol/L）的培养液干预2h之后，LPS组及青藤碱组加LPS至终浓度100ng/mL，空白组加入等体积的PBS。继续培养8h后，分别收集上清用于ELISA检测，再收集细胞RNA裂解液，每孔加入500μLTrizol裂解液，吹打细胞裂解后收集至EP管中，-70℃保存待测。1.6ELISA检测小鼠血清及细胞上清中TNF-α或IL-6取小鼠血清或细胞上清，适当稀释后，按照ELISA检测试剂盒说明书进行TNF-α或IL-6的检测。多功能酶标仪检测吸光度。1.7RT-PCR检测嘌呤受体A2A、P2X7mRNA的表达采用Trizol裂解肝脏、脾脏组织及巨噬细胞，提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。RT-PCR中所用的引物由生工生物工程公司合成。P2X7：上游5’-ATTATGGCACCGTCAAGTGG-3’，下游5’-TCAGTAGGACACCAGGCAGA-3’，产物439bp；A2A：上游5’-CCTGCACATCATCAACTGCT-3’，下游5’-TGCTCCTGGGTAAGAAGCTC-3’，产物411bp；β-actin：上游5’-TATGCCAACACAGTGTTGTCTGG-3’，下游5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’，产物206bp。PCR扩增条件：94℃、3min，然后94℃、30s，60℃、30s，72℃、1min，共40个循环，然后72℃、5min，最后4℃无限循环，反应结束。使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：恒压110V，50min。使用Tanon1600全自动数码凝胶图像分析系统进行拍照及分析。1.9统计学处理实验数据用SPSS17.0forwindows统计软件包处理分析，统计方法使用One-WayANOVA及LSD检验，数据用X±S表示，P0.05表示有统计学意义。2结果2.1青藤碱对内毒素血症模型小鼠血清TNF-α、IL-6含量的影响由图1可见，给予LPS刺激1h时，模型组血清TNF-α含量高于空白对照组，青藤碱40mg/kg组、80mg/kg组、160mg/kg组均显著低于模型组，均有统计学差异（p0.05）。青藤碱各剂量组之间有统计学差异（p0.05），表明青藤碱对TNF-α的抑制有剂量依赖性。由图2可见，给予LPS刺激3h时，模型组血清IL-6含量高于空白对照组，有统计学差异（p0.05），青藤碱组IL-6低于模型组，有统计学差异（p0.05）。①p0.05，与空白组比较；②p0.05，与模型组比较图1不同剂量青藤碱对小鼠血清TNF-α的影响(sx)Fig.1EffectofdifferentconcentrationsofsinomenineonTNF-αinmiceserum①p0.05，与空白组比较；②p0.05，与模型组比较图2青藤碱对小鼠血清IL-6的影响(sx)Fig.2EffectofsinomenineonIL-6inmiceserum2.2青藤碱对LPS刺激的RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响由图3可见，给予LPS刺激时，LPS组血清TNF-α含量高于空白对照组，有统计学差异（p0.05），青藤碱(300μmol/L)组TNF-α低于LPS组，有统计学差异（p0.05）。①p0.05，与空白组比较；②p0.05，与模型组比较图3青藤碱对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响(sx)Fig.3EffectofsinomenineonserumTNF-αsecretioninRAW264.7cells2.3青藤碱对小鼠肝脏、脾脏嘌呤受体A2A表达的影响如图4、5所示，在小鼠肝脏、脾脏扩增到250～500bp大小的产物，与预期扩增A2A的411bp目的条带一致。内参β-actin为206bp。经相对表达量的计算（表1），模型组小鼠肝脏、脾脏A2A受体的表达水平均高于空白组，有统计学差异（p0.05）；青藤碱组小鼠肝脏、脾脏A2A受体的表达水平均低于模型组，有统计学差异（p0.05）。M.marker；1、2空白组；3、4模型组；5、6Sin组图4小鼠肝脏A2AmRNA的RT-PCR电泳图(sx)Fig4ResultsofRT-PCRforA2AmRNAinmiceliverM.marker；1、2空白组；3、4模型组；5、6Sin组图5小鼠脾脏A2AmRNA的RT-PCR电泳图(sx)Fig5ResultsofRT-PCRforA2AmRNAinmicespleen表1各组小鼠肝脏、脾脏A2A的mRNA相对表达量（sx，n=5）Table1ComparisonofA2Aoftheliverandspleenindifferentgroups组别剂量/mg·kg-1肝脏A2A/β-actin脾脏A2A/β-actin空白-0.76±0.0030.83±0.002模型-0.96±0.002①0.93±0.002①青藤碱400.88±0.002②0.75±0.001②①p0.05，与空白组比较；②p0.05，与模型组比较2.4青藤碱对小鼠肝脏、脾脏嘌呤受体P2X7表达的影响如图7、8所示，在小鼠肝脏、脾脏扩增到250～500bp大小的产物，与预期扩增P2X7的439bp目的条带一致。内参β-actin为206bp。经相对表达量的计算（表2），模型组小鼠肝脏、脾脏P2X7受体的表达水平均高于空白组，有统计学差异（p0.05）；青藤碱组小鼠肝脏、脾脏P2X7受体的表达水平均低于模型组，有统计学差异（p0.05）。M.marker；1、2空白组；3、4模型组；5、6Sin组图6小鼠肝脏P2X7mRNA的RT-PCR电泳图(sx)Fig6ResultsofRT-PCRforP2X7mRNAinmiceliverliverM.marker；1、2空白组；3、4模型组；5、6Sin组图7小鼠脾脏P2X7mRNA的RT-PCR电泳图(sx)Fig7ResultsofRT-PCRforP2X7mRNAinmicespleen表2各组小鼠肝脏、脾脏P2X7的mRNA相对表达量（sx，n=5）Table2ComparisonofP2X7oftheliverandspleenindifferentgroups组别剂量/mg·kg-1肝脏P2X7/β-actin脾脏P2X7/β-actin空白-0.49±0.010