5.2-多聚酶链式反应扩增DNA片段

1.DNA的基本单位－①②③④⑤脱氧核苷酸（脱氧核糖核酸）五碳糖磷酸基团羟基3，端5，端ATGCATGC5，端（含磷酸基团）3，端（含羟基）3，端5，端2.脱氧核苷酸链的形成3.DNA分子的双螺旋结构⑴DNA分子是由的脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则结构。⑵与交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；排列在链的内侧。⑶两条链上的碱基通过连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与配对，一定同胞嘧啶配对。双螺旋两条反向平行脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶鸟嘌呤4.复制过程参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸催化合成DNA子链3’5’5’3’因此，DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。4.复制过程是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定。一、基础知识解旋酶（打开DNA双链）DNA母链（模板）4种脱氧核苷酸（合成子链原料）DNA聚合酶（催化子链合成）引物（RNA）（使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸）自主阅读P59，并思考：体外扩增DNA，需要怎样环境？变性（80-100℃）Taq聚合酶（耐高温）20—30个核苷酸构成DNADNA母链4种脱氧核苷酸缓冲溶液，控制温度PCR技术总结利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DNA分子的扩增。四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、引物、DNA模板、缓冲溶液和控制温度的温控设备。子链的5’端向3’端延伸具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA55555555经n次循环（复制）后，DNA的含量理论上可以扩大到倍。2n每次循环分为：PCR的反应过程总结变性——复性——延伸②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸PCR的反应结果二、PCR反应的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。能够自动调控温度的仪器（二）PCR的操作步骤（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上离心约10s（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延伸第一次94°C,10min－－30次９4℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（一）理论上DNA扩增数目的计算1.一条DNA，复制n次，DNA为。2.a条DNA，复制n次，DNA为。三、结果分析与评价2nax2n（二）实验中DNA含量的测定可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关练习巩固1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技术最突出的优点是A原理简单B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐热性D快速、高效、灵活、易于操作从子链的5’端向3’端延伸4、做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是A反复洗涤B不怕外源DNA污染C高压灭菌D在—20℃储存体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向子链的5’端向3’端延伸子链的5’端向3’端延伸课堂小结多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR仪设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算