DB22T 3087-2019 猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别qPCR法

ICS11.220B41DB22吉林省地方标准DB22/T3087—2019猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别qPCR法IdentificationofclassicalandvariantstrainsofporcineepidemicdiarrheavirusReal-timePCRmethod2019-12-25发布2020-02-01实施吉林省市场监督管理厅发布DB22/T3087—2019I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学。本标准主要起草人：张双、王开、郭衍冰、裴志花、黄海龙、朱俊辉、李响、胡桂学。DB22/T3087—20191猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别qPCR方法1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株qPCR法技术的要求。本标准适用于猪流行性腹泻病毒经典毒株与变异毒株的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T36871猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。qPCR:实时荧光定量PCR(Real-timepolymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid)Rnase：核糖核酸酶(ribonuclease)Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4原理在普通聚合酶链反应的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。5试验条件5.1生物安全措施所有培养物和废弃物的处置应符合GB19489的规定。5.2防污染措施DB22/T3087—20192防止污染措施应符合GB/T27401的规定。6试剂和材料6.1试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。6.1.1RNA提取试剂盒。6.1.2反转录试剂盒。6.1.3Rnasefreewater。6.1.4ROXReferenceDyeⅡ。6.1.5qPCRProbeMasterMix。6.1.6阳性对照，以猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777（GenBank：AF353555.1）和变异毒株HB-2012-1（GenBank：JX435302.1）的cDNA或含目的片段的阳性质粒。6.1.7阴性对照，Rnasefreewater。6.2耗材6.2.1无RNase离心管，0.2mL，1.5mL。6.2.2无RNase吸头，10μL。6.2.3吸头，10μL，200μL，1000μL。6.2.4qPCR反应管，根据qPCR仪选配。6.3引物和探针表1qPCR的引物序列和浓度引物和探针名称序列5’―3’浓度pmol/µL扩增片段大小bp上游引物FAYTTTAGGCGGTTCTTTTC20下游引物RARATACCATGAACGCCACT20探针CHEX-GCAGTTGTYGYACTGGGCGGTT-TAMRA10探针VFAM-GCCGTCGTYGYTTTGGGTGGTT-TAMRA101357仪器7.1高速冷冻离心机，12000r/min以上。7.2可调移液器，最大量程为10μL，200μL，1000μL。7.3恒温水浴锅，控温范围为室温至100℃。7.4冰箱，-20℃。7.5多通道荧光定量qPCR扩增仪。8样品样品的采集和处理应符合GB/T36871的规定。DB22/T3087—201939操作步骤9.1RNA提取和反转录使用RNA提取试剂盒（6.1.1）提取样品RNA后，按照反转录试剂盒(6.1.2)说明书要求制备cDNA。以提取的cDNA为模板进行qPCR扩增，或置于-20℃冰箱保存(7.4)，一周内使用。9.2反应体系9.2.1qPCR扩增反应体系见表2。表2qPCR反应体系试剂剂量Rnasefreewater7.1μL模板1.0μL上游引物F0.5μL下游引物R0.5μL探针C0.3μL探针V0.3μLROXReferenceDyeⅡ0.3µLqPCRProbeMasterMix10.0μL总体积20.0μL9.2.2以Rnasefreewater(6.1.3)为阴性对照，以猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777（GenBank：AF353555.1）和变异毒株HB-2012-1（GenBank：JX435302.1）的cDNA或含目的片段的阳性质粒为阳性对照。9.3反应程序qPCR反应程序见表3。表3qPCR反应程序反应步骤温度/℃时间循环数次第一步505min19510min第二步6035s4010结果判定10.1结果分析条件设定试验结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。10.2质控标准DB22/T3087—2019410.2.1阴性对照无Ct值并且无典型扩增曲线。10.2.2阳性对照的Ct值应＜30，并出现特定的扩增曲线。10.2.3如阴性对照和阳性对照不满足以上所有条件，实验结果视为无效。10.3结果描述及判定10.3.1无Ct值，无典型的扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为阴性。10.3.2HEX荧光信号Ct值＜35，出现典型的扩增曲线参见附录A.1，判为猪流行性腹泻病毒经典毒株阳性。FAM荧光信号Ct值＜35，出现典型的扩增曲线参见附录A.2，判为猪流行性腹泻病毒变异毒株阳性。同时出现以上两种曲线参见附录A.3，判为猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株均为阳性。10.3.335≤Ct＜37，出现特定的扩增曲线，样品判为疑似。应重新采样检测，结果仍为疑似，判定为阳性。DB22/T3087—20195A附录A（资料性附录）qPCR扩增图变异毒株参考扩增图见图A.1。图A.1变异毒株扩增经典毒株参考扩增图见图A.2。图A.2经典毒株扩增经典与变异毒株参考扩增图见图A.3。DB22/T3087—20196图A.3同时扩增经典与变异毒株————————————————————————