DB34T 1943-2013 猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测套式RT-PCR方法

ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T1943—2013猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测套式RT-PCR方法MethodofdetectionanddifferentiationofvirulentandvaccinestrainsofclassicalswinefevervirusbynestedRT-PCR2013-08-28发布2013-09-28实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1943—2013I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽安泰农业开发有限责任公司、安徽浩翔农牧有限公司、蚌埠市八大集种猪场提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽安泰农业开发有限责任公司、安徽浩翔农牧有限公司、蚌埠市八大集种猪场。本标准主要起草人：孙裴、李郁、魏建忠、朱良强、殷宗俊、杨勇、何长生、高亚飞、占松鹤、曾祥明、秦娟。DB34/T1943—20131猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测套式RT-PCR方法1范围本标准规定了猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）野毒株与疫苗株鉴别检测的套式RT-PCR方法。本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核酸的检测及野毒株与疫苗免疫毒株的鉴别。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T27540猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1强毒株能使猪产生临床症状和死亡的猪瘟病毒株称猪瘟病毒强毒株。3.2疫苗株能够引起机体免疫应答，但不能或轻微能使猪产生临床症状的猪瘟病毒株称猪瘟病毒疫苗株。4试剂和材料4.1试剂除另有说明，所有试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。4.2TrizolRNA提取试剂，包装瓶用锡箔纸包裹，于4℃～8℃保存。氯仿：4℃预冷。4.3异丙醇DB34/T1943—201324℃预冷。4.475％乙醇用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。4.5DEPC水去离子水中加入0.1％DEPC，37℃作用1h，（121±2）℃，高压灭菌15min。4.6RNA酶抑制剂（30U/μL）。4.710×PCRbuffer（10mmol/LpH8.3Tris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2）。4.8dNTP（2.5mmol/L）。4.9用于RT-PCR反应的引物浓度为10μmol/L，其序列如下：——套式第一步上游引物F1：5-GTAGCAAGACTGGRAAYAGGTA-3,Y=C或T,R=A或G；——套式第二步上游引物F2：5-ACCCTRTTGTARATAACACTA-3，Y=C或T,R=A或G；——共用下游引物R：5-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3。4.10反转录酶SuperscriptⅢ反转录酶（200U/μL）4.11DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（5U/μL）4.12阴性对照DEPC水。4.13阳性对照中国猪瘟兔化弱毒疫苗（C株）、标准Shimen强毒株。5器材和设备5.1高速台式冷冻离心机：最大离心力12000g以上。5.2冰箱5.3PCR检测仪5.4组织匀浆器5.5微量移液器和吸头5.6离心管5.7样品的采集6样品的采集6.1采样注意事项DB34/T1943—20133采样及样品前处理过程应戴一次性手套，样本不得交叉污染。6.2采样工具扁桃体采样器：鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3％氢氧化钠溶液浸泡消毒5min～10min，经清水冲洗。灭菌牙签和0.5mL或1.5mL离心管经（121±2）℃，高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干烤2h。6.3采样方法6.3.1活体样品固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至0.5mL或1.5mL离心管并作标记，编号，送实验室。取待检样品，按1:5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，3000g离心15min，取上清液转入离心管中编号备用。6.3.2内样样品采取病死猪各种脏器（淋巴结、脾脏、肝脏、回肠、肾脏）装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。取50mg～100mg待检样品，按1:5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，3000g离心15min，取上清液转入离心管中编号备用。6.3.34％EDTA抗凝血用无菌注射器抽取全血，注入含1/104％EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀后编号备用。6.3.4排泄物挑取少许粪便样本于离心管中，加入适量生理盐水，振荡混匀，室温3000g离心15min，取上清液转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转入离心管编号备用。6.3.5细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入离心管中编号备用。6.3.6存放与运送采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6h～8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7套式RT-PCR检测7.1核酸提取在样本制备区，按照GB/T27540的规定进行。7.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数×重复数3+阳性管数2+阴性管数1，对每个离心管进行编号。DB34/T1943—201347.1.2每管加入500μLTrizol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL（检测过程各管不得交叉污染），颠倒10次混匀，静止5min；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5s（也可以用手反复颠倒混匀）。于4℃、12000g离心15min。7.1.3取与7.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加入500μL异丙醇（4℃预冷），对每个管进行编号。取7.1.2中离心后的上清液约500μL（注意不要吸出中间层）转移至相应的管中，颠倒混匀，-20℃静置30min。7.1.4于4℃、12000g离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入600μL75％乙醇，颠倒洗涤。7.1.5于4℃、12000g离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）。7.1.64000g离心10s（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3min～10min。7.1.7加入38μL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增；若需上期保存应放置-70℃冰箱。7.2cDNA合成7.2.1吸取5μL上述RNA溶液至PCR管中。7.2.2加入1μL50pmol/L的下游引物，68℃作用5min，冰水浴中降温（或在PCR仪中采用程序：68℃反应5min，置于4℃结束反应）。7.2.3加入下列试剂：——2μL5×第一链缓冲液（firststrandbuffer）——0.5μL0.1mol/LDTT——0.5μLdNTP（10mmol/L）——0.25μLRNA酶抑制剂（RNaseinhibitor）PCR仪中50℃反应60min，75℃温浴10min，置于4℃结束反应。7.3PCR7.3.1吸取上述cDNA模版3μL，DEPC水34.5μL。7.3.2加入下列试剂：——5μL10×PCR缓冲液——3μLdNTP（10mmol/L）——1μL上游引物F1——1μL下游引物R——2.5μLHSTaqDNA聚合酶将混合物吹打均匀后，至PCR仪中扩增，条件如下：94℃预热3min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃链延伸40s，35个循环，72℃温育7min。置于4℃结束反应。7.4套式PCR7.4.1吸取上述PCR模版1.5μL，DEPC水36μL。7.4.2加入下列试剂：——5μL10×PCR缓冲液——3μLdNTP（10mmol/L）——1μL上游引物F2DB34/T1943—20135——1μL下游引物R——2.5μLHSTaqDNA聚合酶将混合物吹打均匀后，至PCR仪中扩增，条件如下：94℃预热3min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃链延伸40s，35个循环，72℃温育7min。置于4℃结束反应。7.5电泳取6μL～10μLPCR产物在4％琼脂糖凝胶中进行电泳，缓冲液为0.5×TBE，100V、40min。7.6凝胶成像及结果判定阳性样品（中国猪瘟兔化弱毒疫苗C株）出现149bp大小条带、阳性样品（标准强毒Shimen毒株）出现135bp大小条带、阴性样品无条带出现时，试验成立。被检测样品出现149bp大小条带为猪瘟疫苗株，出现135bp大小条带为猪瘟野毒株，否则为阴性，见图1。图中：——1、2：猪瘟疫苗株；——3、4：猪瘟强毒株；——5、6：阴性对照；——M：Marker。图1_________________________________