DB34T 2253-2014 水产品中硝基呋喃类代谢物残留的检测 胶体金免疫层析法

ICS67.050B50DB34安徽省地方标准DB34/T2253—2014水产品中硝基呋喃类代谢物残留的检测—胶体金免疫层析法Detectionofnitrofuranmetabolitesresiduesinaquaticproducts-Colloidalgoldimmunochromatographicmethod文稿版次选择2014-12-17发布2015-01-17实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2253—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由合肥市渔政监督管理站提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：合肥市畜牧水产技术推广中心、合肥市渔业协会、杭州南开日新生物技术有限公司。本标准起草人：赖年悦、孙德祥、桑丽雅、周作友、徐薇、陈友顺、杨锐、曹海、张军、夏俊华、陈元生、程定文、方凯、钱继银、桂淦、胡积清、戴靖、陈晓荣、徐丽、沈亭海、徐经云、张凯。DB34/T2253—20141水产品中硝基呋喃类代谢物残留的检测-胶体金免疫层析法1范围本标准规定了水产品中硝基呋喃类代谢物残留的检测——胶体金免疫层析法的原理、试剂和材料、仪器和设备、测定步骤、结果判断及表述、结果确证的方法。本标准适用于鱼、甲鱼、龟肌肉组织和虾、蟹去壳、肠腺的可食用组织中呋喃唑酮的代谢物3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、呋喃西林的代谢物氨基脲（SEM）、呋喃它酮的代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）和呋喃妥因的代谢物1-氨基-乙内酰脲（AHD）的快速筛查检测。本方法呋喃唑酮代谢物、呋喃西林代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃妥因代谢物的检出限均为1.0μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理本法为竞争抑制法，将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。样品中残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下衍生，碱性条件下经乙酸乙酯萃取、正己烷去脂净化后，滴加在免疫胶体金快速检测板加样孔中，样品溶液以硝酸纤维素（NC）膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用缓慢向另一端渗移，在移动过程中，样品溶液中的硝基呋喃类代谢物的衍生物与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，从而抑制了抗体和检测线上特异性结合抗原的结合，未被硝基呋喃类代谢物的衍生物结合的抗体与检测线上的抗原反应，并通过胶体金的颜色而显示红色条带。用胶体金读卡仪或目测比较板/卡上控制线（C线）和检测线（T线）上红色条带的有无及颜色的相对深浅进行判定。当样品中的硝基呋喃类代谢物含量达到或超过本方法检出限时，检测线较控制线显色淡甚至无显色，判定为阳性。反之，当试样中的硝基呋喃类代谢物含量在本方法检出限以下或无残留时，检测线与控制线显色一致或偏深，判定为阴性。4试剂和材料4.1除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的二级水。4.2浓盐酸：质量分数≥37%4.3氢氧化钠（NaOH）。4.4磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）。4.5二硝基苯甲醛（2-NP）。4.6甲醇（CH3OH）。4.7乙酸乙酯（C4H8O2）。DB34/T2253—201424.8正己烷（C6H14）。4.91mol/L盐酸溶液：量取8.6mL浓盐酸，加蒸馏水定容至100mL。4.10衍生化试剂：称取0.15g二硝基苯甲醛，加甲醇100mL溶解，4℃避光保存。4.110.1mol/L磷酸氢二钾溶液：称22.8g磷酸氢二钾（4.4），加蒸馏水溶解，定容至1000mL。4.121mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠，加蒸馏水定容至100mL。4.13硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板4.13.1硝基呋喃类代谢物结合抗原：偶联率为1:10～1:20（载体蛋白：NPAOZ/NPSEM/NPAMOZ/NPAHD）。4.13.2抗硝基呋喃类代谢物的衍生物抗体：多抗或单抗。多抗效价应大于5000（间接ELISA法），或有效抗体含量应大于0.05mg/mL；特异性应大于5000（间接抑制ELISA法）。单抗效价应大于15000（间接ELISA法），或有效抗体含量应大于0.5mg/mL；特异性应大于5000（间接抑制ELISA法）。抗体相对亲和力应大于3.0×109（结合率下降50％时，相对应的抗体浓度的倒数）。4.13.3样品垫：玻璃纤维或纸质薄片。4.13.4金释放垫：聚酯纤维片，免疫金释放时间小于5min，释放效率大于80％。4.13.5NC膜：4cm毛细管121s～149s。4.13.6吸水垫：滤纸或玻璃纤维或吸水纸。4.13.7背衬：PVC。4.13.8塑料模板：内置4个试纸条卡槽。4.13.9PBST缓冲液。4.13.10储存与使用。密封包装，干燥阴凉处保存，用前恢复至室温，即开即用。5仪器和设备5.1电子天平：感量0.01g。5.2均质机：转速≥8000r/min。5.3涡旋混合仪：转速0～3000r/min5.4离心机：离心力≥3000g。5.5氮气或空气吹干仪：加热温度≥60℃。5.6恒温水浴锅：加热温度≥60℃。5.7微量移液器：10μL～100μL，100μL～1000μL。5.8胶体金读卡仪：测量精度±0.02RLU（@0.4RLU）、±0.04RLU（@0.4RLU）。6测定步骤6.1试样制备鱼去鳞、去皮，取肌肉部分；甲鱼、龟取肌肉部分；虾、蟹去壳、肠腺，取可食部分。切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混合，用均质机制成糜状。注：虾、蟹的壳必须去除干净，不得带入试样中。6.2提取称取2.0g(±0.1g)均质后的样品于50mL离心管中，依次加入4mL去离子水，0.5mL1mol/L盐酸溶液（4.9），0.1mL衍生化试剂（4.10），充分混合3min。置于60℃水浴锅中孵育1h（注意避光）；取出，依次加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（4.11），0.4mL1mol/L氢氧化钠溶DB34/T2253—20143液（4.12）和6mL乙酸乙酯，充分混合1min，3000g离心5min；移取上层溶液3mL于5mL离心管中，置于60℃水浴或吹干仪中，用氮气或空气吹至近干；加入1mL正己烷，加盖振荡1min，再加入0.5mLPBST缓冲液（4.13.9），充分混匀，3000g离心1min，下层溶液待测。6.3测定6.3.1试样测定：取出硝基呋喃类代谢物免疫胶体金快速检测试剂板，恢复至室温，置于水平台面上。分别吸取待测液下层溶液100µL，滴加于4种硝基呋喃代谢物目标物加样孔中，在3min～5min内目测或通过胶体金读卡仪读取结果。6.3.2空白对照：每批样品需做一孔空白对照，以PBST缓冲液（4.13.9）代替试样提取液，按6.3.1进行。6.3.3平行测定：每个样品的平行样数量≥2，各自按6.2和6.3.1进行。注：不同试剂板制造商的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。7结果判断及表述7.1试剂板有效性判定7.1.1失效检测试剂板：空白对照控制线（C线）不出现红色条带（如图1），则检测试剂板失效，不能进行检测。7.1.2有效检测试剂板：空白对照控制线（C线）和检测线（T线）均出现红色条带，且T线比C线颜色深或一样深（如图2），则检测试剂板有效，可进行检测。7.2结果及表述7.2.1阴性：试样检测线（T线）出现红色条带，且颜色比控制线（C线）深或一样深（如图2），结果为阴性（硝基呋喃类代谢物1.0μg/kg）。7.2.2阳性：试样检测线（T线）出现红色条带，且颜色比控制线（C线）浅，或检测线（T线）未出现红色条带（如图3），结果为阳性（硝基呋喃类代谢物≥1.0μg/kg）。8结果确证本方法检测结果为阳性的样品，需用现行有效的LC-MS/MS方法进行确证。_________________________________