DB34T 2254-2014 水产品中氯霉素残留的检测-胶体金免疫层析法

ICS67.050B50DB34安徽省地方标准DB34/T2254—2014水产品中氯霉素残留的检测—胶体金免疫层析法Detectionofchloramphenicolresidueinaquaticproducts-Colloidalgoldimmunochromatographicmethod文稿版次选择2014-12-17发布2015-01-17实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2254—2014I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由合肥市渔政监督管理站提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：合肥市畜牧水产技术推广中心、合肥市渔业协会、杭州南开日新生物技术有限公司。本标准起草人：赖年悦、孙德祥、桑丽雅、周作友、徐薇、陈友顺、杨锐、曹海、张军、夏俊华、陈元生、程定文、方凯、钱继银、桂淦、胡积清、戴靖、陈晓荣、徐丽、沈亭海、徐经云、季曙春。DB34/T2254—20141水产品中氯霉素残留的检测-胶体金免疫层析法1范围本标准规定了水产品中氯霉素（Chloramphenicol，CAP）残留的检测——胶体金免疫层析法的原理、试剂和材料、仪器和设备、测定步骤、结果判断及表述、结果确证的方法。本标准适用于鱼、甲鱼、龟肌肉组织和虾、蟹去壳、肠腺的可食用组织中氯霉素残留的快速筛查检测。本方法的检出限为0.3μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理本法为竞争抑制法，将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。样品中残留的氯霉素，经乙酸乙酯提取，正己烷净化，滴加在氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板的加样孔中，样品溶液以硝酸纤维素（NC）膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用缓慢向另一端渗移，在移动过程中，样品溶液中的氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，从而抑制了抗体和检测线上特异性结合抗原的结合，未被氯霉素结合的抗体与检测线上的抗原反应，并通过胶体金的颜色而显示红色条带。用胶体金读卡仪或目测比较板/卡上控制线（C线）和检测线（T线）上红色条带的有无及颜色的相对深浅进行判定。当试样中的氯霉素含量达到或超过本方法检出限时，检测线较控制线显色淡甚至无显色，判定为阳性；反之，当试样中的氯霉素含量在本方法检出限以下或无残留时，检测线与控制线显色一致或偏深，判定为阴性。4试剂和材料4.1特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的二级水。4.2乙酸乙酯（C4H8O2）。4.3正己烷（C6H14）。4.4氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板4.4.1氯霉素结合抗原：偶联率为1∶10～1∶20（载体蛋白：CAP）。4.4.2抗氯霉素抗体：多抗或单抗。多抗效价应大于5000（间接ELISA法），或有效抗体含量应大于0.05mg/mL；特异性应大于5000（间接抑制ELISA法）。单抗效价应大于15000（间接ELISA法），或有效抗体含量应大于0.5mg/mL；特异性应大于5000（间接抑制ELISA法）。抗体相对亲和力应大于3.0×109（结合率下降50％时，相对应的抗体浓度的倒数）。DB34/T2254—201424.4.3样品垫：玻璃纤维或纸质薄片。4.4.4金释放垫：聚酯纤维片，免疫金释放时间小于5min，释放效率大于80％。4.4.5NC膜：4cm毛细管时间121s～149s。4.4.6吸水垫：滤纸或玻璃纤维或吸水纸。4.4.7背衬：PVC。4.4.8塑料模板。4.4.9PBST缓冲液。4.4.10储存与使用。密封包装，干燥阴凉处保存，用前恢复至室温，即开即用。5仪器和设备5.1电子天平：感量0.01g。5.2均质机：转速≥8000r/min。5.3离心机：离心力≥3000g。5.4氮气或空气吹干仪：加热温度≥60℃。5.5微量移液器：10μL～100μL，100μL～1000μL。5.6胶体金读卡仪：测量精度±0.02RLU（@0.4RLU）、±0.04RLU（@0.4RLU）。6测定步骤6.1试样制备鱼去鳞、去皮，取肌肉部分；甲鱼、龟取肌肉部分；虾、蟹去壳、肠腺，取可食部分。切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混合，用均质机制成糜状。6.2提取称取2.0g(±0.1g)均质后的样品于5mL离心管中，加入3mL乙酸乙酯，剧烈振荡3min，室温下，3000g离心5min；移取2mL上清液于5mL离心管中，置于60℃水浴或吹干仪中，用氮气或空气吹至近干；依次加入0.3mL正己烷、0.3mLPBST缓冲液，充分混匀；静置2min，下层溶液待测。6.3测定6.3.1取出氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板，恢复至室温，置于水平台面上。吸取6.2中待测液的下层溶液100μL，加至氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板的加样孔中，在3min～5min内目测或通过胶体金读卡仪读取结果。6.3.2空白对照：每批样品需做一孔空白对照，以PBST缓冲液（4.4.9）代替试样提取液，按6.3.1进行。6.3.3平行测定：每个样品的平行样数量≥2，各自按6.2和6.3.1进行。注：不同试剂板制造商的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。7结果判断及表述7.1试剂板有效性判定DB34/T2254—201437.1.1失效检测试剂板：空白对照控制线（C线）不出现红色条带（如图1），则检测试剂板失效，不能进行检测。7.1.2有效检测试剂板：空白对照控制线（C线）和检测线（T线）均出现红色条带，而且T线比C线颜色深或一样深（如图2），则检测试剂板有效，可进行检测。7.2结果及表述7.2.1阴性：试样检测线（T线）出现红色条带，且颜色比控制线（C线）深或一样深（如图2），结果为阴性，氯霉素残留量0.3μg/kg）。7.2.2阳性：试样检测线（T线）出现红色条带，但颜色比控制线（C线）浅或检测线（T线）未出现红色条带（如图3），结果为阳性（氯霉素残留量≥0.3μg/kg）。8结果确证本方法检测结果为阳性的样品，需用现行有效的LC-MS/MS方法或GC-MS/MS方法进行确证。_________________________________