DB34T 2515-2015 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T2515—2015猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法RT-PCRassayforporcineepidemicdiarrheavirus文稿版次选择2015-11-10发布2015-12-10实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2515—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。本标准由安徽省农业标准化委员会归口。本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：潘孝成、张丹俊、赵瑞宏、沈学怀、周学利、胡晓苗、戴银、侯宏艳、李贺侠、张宁、何国荣、周德权、王庆。DB34/T2515—20151猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）RT-PCR检测方法及其技术要求。本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PEDV核酸的检测。2缩略语下列缩略语适用于本文件。PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus）PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（trisacetate-EDTAbuffer）EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）3原理PEDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。4仪器4.1PCR仪扩增仪。4.2台式低温高速离心机。4.3电泳仪。4.4凝胶成像系统。4.5冰箱。4.6微波炉。4.7分析天平。DB34/T2515—201524.8水浴锅。4.9微量移液器。5试剂和材料5.1RNA抽提试剂：Trizol。5.2氯仿、异丙醇、乙醇。5.3M-MLV反转录酶。5.4RNA酶抑制剂。5.5DEPC处理的灭菌水。5.6TaqDNA聚合酶。5.7dNTP。5.8DL2000DNAMarker。5.9RT-PCR反应试剂。5.10溴化乙锭（EB，10µg/µL）或核酸染料。5.11磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），见附录A中的A.1。5.1250×TAE电泳缓冲液，见附录A中的A.2。5.131％琼脂糖凝胶，见附录A中的A.3。5.14引物：——上游引物5’-GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC-3’，——下游引物5’-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3’，——引物浓度10pmol/µL。5.15阳性对照样品：PEDV接种的VERO细胞培养物，阴性对照样品：正常VERO细胞培养物。6操作步骤6.1样品的采集及处理6.1.1采样工具15mL离心管、1.5mL离心管、剪刀、镊子和研钵，经121（±2）℃，15min高压灭菌并烘干。6.1.2肠内容物的采集与处理采取病死或剖杀猪的小肠内容物，按1:5倍体积加入PBS，研磨冻融3次，装入15mL灭菌离心管中，8000rpm离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。6.1.3粪便的采集与前处理取发病猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1:5倍体积加入PBS，混匀，8000rpm离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。6.1.4细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。6.2RNA提取DB34/T2515—201536.2.1用Trizol提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的RNA。6.2.2200μL的样品和800μLTrizol置于一个1.5mL离心管，反复颠倒混匀，室温静置5min。6.2.312000g4℃离心5min，吸取上清移入新的离心管中，加入200μL氯仿，用手剧烈振荡15s，室温静置5min。6.2.412000g4℃离心15min，吸取上层水相移入新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。6.2.512000g4℃离心10min，小心弃去上清，加入75％乙醇1mL（DEPC水配制）。6.2.612000g4℃离心5min，弃去乙醇，室温干燥2～5min，加入适量DEPC水，-80℃保存备用。6.3反转录6.3.1在PCR反应管中依次加入：——OligodTPrimer1μL，dNTPs(10mM)1μL，实验样品RNA3μL，DEPC水6μL。6.3.2水浴锅或PCR仪中，65℃作用5min，冰上急冷2min。6.3.3在上述反应管中再依次加入：——5×RTBuffer4μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，M-MLV反转录酶（200U/μL）1μL，DEPC水4.5μL。6.3.4PCR仪中，42℃作用60min，再70℃作用15min，-20℃保存备用。6.4PCR6.4.1PCR反应体系10×PCRBuffer2.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTPs(2.5mml/L)2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，反转录产物5μL，灭菌去离子水13.25μL。6.4.2PCR反应条件94℃预变性5min后；94℃1min，52℃50s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min。7电泳将PCR扩增产物5μL与2μL上样缓冲液混合，点样于1％琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker（分子质量标准物），缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳30min左右。8结果判定当阳性对照出现663bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果成立。被检样品出现663bp扩增条带为PEDV核酸阳性，未出现663bp扩增条带的样品判为PEDV核酸阴性。图1为一次检测结果图示。DB34/T2515—20154图中：M——DL2000Marker；1——阴性对照样品；2——阳性对照样品；3、4——阳性样品。图1PCR扩增电泳图100bp-250bp-500bp-750bp-1000bp-2000bp-M1234DB34/T2515—20155AA附录A（规范性附录）试剂配制A.10.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）的配制A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.6g，先加适量灭菌去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）27.6g，先加适量灭菌去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.3量取0.2moL/L磷酸氢二钠溶液36mL，0.2mol/L磷酸二氢钠溶液14mL，称取氯化钠8.5g，用灭菌去离子水溶解稀释至1000mL，4℃保存。A.2电泳缓冲液（50倍）A.2.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）——二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）18.61g——灭菌双蒸水80mL——氢氧化钠调pH至8.0——灭菌双蒸水加至100mLA.2.2TAE电泳缓冲液（50×）——羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）242g——冰乙酸57.1mL——0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)100mL——灭菌双蒸水加至1000mLA.31％琼脂糖凝胶——琼脂糖（电泳级）1g——1×TAE电泳缓冲液100mL——微波炉中完全融化，降温至60℃左右，加核酸染料5μL，均匀铺板。_________________________________