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ICS65.120B20DB37山东省地方标准DB37/T577—2005饲料添加剂6位点植酸酶活性的测定分光光度法Determinationoffeedadditive6-phytaseactivitySpectrothotometricmethod2006-01-23发布2006-03-01实施山东省质量技术监督局发布DB37/T577—2005I前言附录A、附录B为资料性附录。本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。本标准负责起草单位:山东省饲料监察所。参加起草单位:济南天天香饲料有限公司。本标准主要起草人:李俊玲、孙延军、郭芳坤、韩冰、战余铭、门晓东。DB37/T577—20052饲料添加剂6位点植酸酶活性的测定分光光度法1范围本标准规定了以分光光度法测定饲料添加剂6位点植酸酶活性的方法。本标准适用于作为饲料添加剂使用的6位点植酸酶产品。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。3定义6位点植酸酶活性单位:样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.00的条件下,每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷,即为一个植酸酶活性单位,以U表示。4方法原理6位点植酸酶在一定温度和pH条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性溶液中,与钒钼酸铵反应生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物,在波长415nm下进行比色测定。5试剂和溶液本标准中所用试剂,均为分析纯试剂,水为符合GB/T6682中规定的三级水。所用器皿洗涤不要用含磷清洗剂。5.1硝酸。5.2氨水。5.3冰醋酸。5.4Tritonx-100。5.5肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)。5.6钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]。5.7三水乙酸钠。5.8偏钒酸铵(NH4VO3)。5.9牛血清蛋白(BSA)。5.10磷酸二氢钾(KH2PO4):基准试剂。5.11乙酸缓冲液(I),0.25mol/L:称取34.02g三水乙酸钠(5.7)于1000mL容量瓶中,加入900mL水溶解,用冰醋酸(5.3)调节pH至5.00±0.01,并用蒸馏水定容至1000mL。室温下有效期2个月。5.12乙酸缓冲液(Ⅱ),0.25mol/L:称取34.02g三水乙酸钠(5.7)、0.5gTritonX-100(5.4)、0.5g牛血清白蛋白(BSA)(5.9)于1000mL容量瓶中,加入900mL水溶解,用冰醋酸(5.3)调节pH至5.00±0.01,并用蒸馏水定容至1000mL。室温下有效期2个月。DB37/T577—200535.13植酸钠溶液,7.5mmol/L:称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)(5.5)于100mL容量瓶中,用0.25mol/L乙酸缓冲液(5.11)溶解并定容至刻度。用冰醋酸(5.3)调节pH至5.00±0.01,现用现配。5.14硝酸溶液:1+2水溶液。5.15钼酸铵溶液,100g/L:称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O](5.6)于100mL容量瓶中,加入1.0mL氨水(5.2),用水溶解并定容至刻度。5.16偏钒酸铵溶液,2.35g/L:称取0.235g偏钒酸铵(NH4VO3)(5.8)于100mL棕色容量瓶中,加入2mL硝酸溶液(5.14),用水溶解定容至刻度。避光条件下保存,一周内有效。5.17颜色终止液:移取2份硝酸溶液(5.14),1份钼酸铵溶液(5.15),1份偏钒酸铵溶液(5.16)混合后使用,现用现配。5.18磷标准液:准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾(5.10)于100mL容量瓶中,用乙酸缓冲液(5.12)溶解,并定容至100mL。此浓度为50.0μmol/mL。6仪器设备6.1电子天平:感量0.1mg。6.2恒温水浴:37℃±0.1℃。6.3分光光度计:附10mm比色皿。6.4磁力搅拌器。6.5漩涡混合器。6.6酸度计:精度±0.01pH。6.7离心机:转速为4000r/min以上。6.8温度计:精度为±0.1℃,最大量程50℃。7试样制备取有代表性样品,用四分法将试样缩分至200g左右,装入密封容器。8测定步骤8.1标准系列的制备:吸取磷标准液(5.18)0.5ml,用乙酸缓冲液(5.12)分别稀释至1.0、2.0、4.0、8.0、16.0ml,混匀。上述标准工作液的浓度分别为25.0、12.5、6.25、3.125、1.562μmol/mL。8.2试样溶液的制备参照附录A中建议的称样量称取试样两份,精确至0.1mg,置于100mL烧杯中,加入约70mL乙酸缓冲液(5.12),在磁力搅拌器(6.4)上搅拌30min,用乙酸缓冲液(5.12)定容至100mL。摇匀,静置,取约10mL上清液,在离心机(6.7)上4000r/min离心10min。移取适量上清液用乙酸缓冲液(5.12)稀释,使样液浓度保持在0.4U/mL左右。8.3反应取10mL试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(5.13)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要一致。37℃水解30min。反应步骤及试剂、溶液用量见表1。表1DB37/T577—20054反应顺序试料(ml)标准(ml)试料空白(ml)标准空白(ml)1.加乙酸缓冲液(5.1)1.81.81.82.02.加入待反应液0.20.20.2-3.混合√√√4.37℃预热5min√√-5.依次加入底物(5.3)444(第二步)6.混合√√√7.37℃水解30min√√-8.依次加入终止液(5.7)444(第一步)9.混合√√√总体积101010注:“√”是按要求操作,“-”不操作。8.4样品测定反应后的试料溶液在室温下静置10min,如出现混浊,需在离心机(6.7)上以4000r/min离心10min。取上清夜,以蒸馏水调零,在分光光度计(6.3)415nm处测定吸光值。同时做标准曲线。9结果计算9.1计算公式试样中6位点植酸酶的活性,用每克试样中的活性单位“U”表示,计算公式如下:X=Dmc××30................(1)式中:X——试样中6位点植酸酶的活性,U/g;C——根据样液的实测吸光值由直线回归方程计算出的酶活性,U;D——试样溶液反应前的总稀释倍数;m——试样质量为克,g;30——反应时间为分钟,min。9.2结果表示以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。保留三位有效数字。10精密度10.1重复性同一实验室两次独立测定结果的相对偏差不大于20%。10.2再现性不同实验室间两次独立测定结果的相对偏差不大于40%。
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