DB37T 667-2007 饲料中喹乙醇的测定 液相色谱质谱联用法

ICS65.120DB37B20山东省地方标准DB37/T667—2007饲料中喹乙醇的测定液相色谱质谱联用法DeterminationofolaquindoxinfeedsbyLC-MS2007-03-09发布2007-05-01实施山东省质量技术监督局发布DB37/T667—2007I前言本标准的附录A、附录B均为资料性附录。本标准由山东省畜牧办公室提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省饲料监察所、农业部饲料效价与安全监督检验测试中心（北京）。本标准主要起草人：梁萌、杨文军、汤文利、任爱丽、孙延军。DB37/T667—20071饲料中喹乙醇的测定液相色谱质谱联用法1范围本标准规定了用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）测定饲料中喹乙醇的方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中喹乙醇的测定。本标准高效液相色谱的最低定量限为1mg/kg，质谱确证限为1mg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3原理饲料样品中的喹乙醇用甲醇溶液提取，过滤后用反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。并采用质谱检测器以喹乙醇的质量色谱峰保留时间和特征离子进行确证。4试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂。水符合GB/T6682一级水的规定。4.1甲醇，色谱纯。4.2乙酸溶液，体积分数是0.1%。4.3碳酸钾。4.4提取液：甲醇+水=5+95。4.5高效液相色谱流动相：甲醇（4.1）+水，采用二元梯度洗脱。4.6液质联用流动相：甲醇（4.1）+乙酸溶液（4.2），采用二元梯度洗脱。4.7淋洗液1：盐酸[c(HCl)=0.1mol/L],移取8.33mL盐酸至1000mL容量瓶中，定容。4.8淋洗液2：盐酸[c(HCl)=0.02mol/L]，移取200mL淋洗液1（4.7）至1000mL容量瓶中，定容。4.9淋洗液3：甲醇（4.1）+水=5+95。4.10洗脱液：甲醇（4.1）+水=40+60。4.11喹乙醇标准液4.11.1喹乙醇标准贮备液称取喹乙醇标准品0.050g，精确到0.1mg（含量≥99.6%），于50ml棕色容量瓶中，加入适量洗脱液（4.10），超声15min溶解，冷却至室温后定容，摇匀，贮存于-18℃冰箱中避光保存，有效期为一个月。4.11.2喹乙醇标准工作液准确移取适量标准储备液（4.11.1）于容量瓶中，用洗脱液（4.10）定容，依次配制成0.1μg/mL、1.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL的标准工作溶液。现用现配。5仪器DB37/T667—200725.1高效液相色谱仪：具紫外检测器。5.2离子阱质谱仪。5.3离心机：3500r/min。5.4具塞塑料离心管：100mL。5.5固相萃取小柱：HLB3CC60mg。5.6超声波振荡器。5.7固相萃取仪。5.8恒温振荡器。6试样的制备按GB/T20195规定执行。7分析步骤7.1提取称取约5g试样，精确到0.1mg，于具塞锥形瓶中，加入0.5g碳酸钾（4.3），加入50.00mL提取液（4.4），具塞置入恒温振荡器中，避光振荡45min（振荡速度110r/min）。提取液在3500r/min下离心10min，上清液经滤纸过滤后保留滤液A，用于固相萃取净化。7.2HLB小柱的活化依次用2mL甲醇（4.1）和2mL水对HLB小柱(5.5)进行活化。7.3净化将混匀的滤液A（7.1）2mL加入活化好的HLB小柱（7.2），分别用3mL淋洗液2（4.8）、淋洗液1（4.7）和淋洗液3（4.9）淋洗小柱，并将小柱吹干。最后用2.00mL洗脱液（4.10）洗脱，收集洗脱液，摇匀，过0.2μm滤膜后待测。对于含喹乙醇较高的试样，调整洗脱液（4.10）用量，使试样溶液中喹乙醇最终浓度为5.0μg/mL-10.0μg/mL。旋涡混匀，过0.2μm微孔滤膜，待测。7.4测定7.4.1色谱参考条件色谱柱:C18柱，250mm×4.6mm，id，5μm，或性能类似分析柱。柱温：室温。检测器：紫外检测器，检测波长260nm。流动相：按表1执行。表1液相色谱流动相梯度洗脱程序时间，min水，%甲醇，%085157851510307014307018851525Stop流速：1mL/min。进样体积：20μL。DB37/T667—200737.4.2定量用紫外检测器测定标准工作液（4.11.2）和洗脱液（7.3）中喹乙醇峰面积的响应值，用多点校准法定量。7.5确证7.5.1质谱参考条件色谱柱:C18柱，250mm×4.6mm，id，5μm，或性能类似分析柱。流动相：按表2执行。表2质谱流动相梯度洗脱程序时间，min0.1%乙酸溶液，%甲醇，%085157851510307014307018851525Stop流速：0.2mL/min。进样量：20μL。离子模式：正离子化，大气压电离源（APCI+）。喹乙醇选择离子：m/z264、246、221、177。雾化气压力：60.0psi。干燥气流速：5.0L/min。干燥气温度：350℃。毛细管出口电压：4000V。喷雾器温度：350℃。离子电荷控制（ICC）:on。7.5.2确证通过样品总离子流色谱图上喹乙醇（m/z264、m/z246、m/z221、m/z177）的保留时间和对应的特征离子与标准品相应的保留时间和对应的特征离子进行对照确证。样品相对峰度比与标准品相对峰度比相差不大于30%。8测定结果的计算试样中喹乙醇的含量以质量分数X计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式（1）计算；A×V1×V2X=——————………………………(1)m×V3式中：A—地西泮色谱峰的峰面积对应的含量的数值，单位为微克每毫升（μg/mL）；V1—加入提取液的体积的数值，单位为毫升（mL）；V2—洗脱液的体积的数值，单位为毫升（mL）；DB37/T667—20074m—试料的质量的数值，单位为克（g）；V3—移取提取液上HLB小柱的体积的数值，单位为毫升（mL）。计算结果表示到三位有效数字。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于两个测定值的算术平均值的7％，以大于这两个测定值的算术平均值的7%情况不超过5％为前提。DB37/T667—20075附录A（资料性附录）喹乙醇特征离子表A.1给出了喹乙醇确证方法的特征离子表A.1喹乙醇确证方法的特征离子特征离子（m/z）264246221177结构式[M+H]+([M+H]-H2O)+([M+H]-CHNO)+([M+H]-C3H6NO2)+DB37/T667—20076附录B（资料性附录）喹乙醇质谱图图B.1给出了喹乙醇的质谱图图B.1喹乙醇质谱图176.8247.8263.81.+MS,5.5-6.0min(#590-#628)159.7176.7211.7220.7228.8245.71.+MS2(263.8),5.6-6.0min(#591-#629)0123456x10Intens.01234565x10100150200250300350m/z