DB41T 1615-2018 食用菌菌丝纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力检测技术规程

ICS65.020.20B05DB41河南省地方标准DB41/T1615—2018食用菌菌丝纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力检测技术规程2018-06-19发布2018-09-19实施河南省质量技术监督局发布DB41/T1615—2018I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所。本标准主要起草人：孔维丽、康源春、袁瑞奇、孔维威、张玉亭、胡素娟、刘芹。本标准参加起草人：段亚魁、宋志波、徐柯、崔筱、孟庆涛、韩玉娥。DB41/T1615—20181食用菌菌丝纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力检测技术规程1范围本标准规定了检测食用菌菌丝羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力的方法。本标准适用于食用菌菌丝培养过程中羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、漆酶、蛋白酶活力的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T601—2016化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T9721—2006化学试剂分子吸收分光光度法通则(紫外和可见光部分)GB/T12728—2006食用菌术语GBT23874—2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定GB/T28715—2012饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法NY/T912—2004饲料添加剂纤维素酶活力的测定3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1羧甲基纤维素酶（CMC）活力单位在37℃，pH值为5.5，每分钟从浓度为0.8%的羧甲基纤维素钠溶液中水解产生1mmol葡萄糖所需要的酶量为1个酶活力单位（U）。3.2木聚糖酶活力单位在37℃，pH值为5.5，每分钟从浓度5mg/mL的木聚糖溶液中水解产生1μmol葡萄糖所需要的酶量为1个酶活单位（U）。3.3蛋白酶活力单位在40℃，相应pH值（中性蛋白酶pH值=7.5，酸性蛋白酶pH值=3，碱性蛋白酶pH值=13）1min水解酪素产生1μg酪氨酸所需要的酶量为1个酶活力单位（U）。3.4漆酶活力单位在室温（25℃～30℃），pH值为5（0.08mol/L醋酸钠缓冲液）条件下，每秒钟氧化1mmol的0.5mmol/L2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（ABTS），所需的酶量为1个酶活力单位（U）.4仪器与设备DB41/T1615—20182分光光度计，波长350nm～800nm;pH计:精度为0.01pH单位;分析天平：精确至0.0001g和0.01g;数显恒温水浴锅:精度为±0.1℃；磁力搅拌器：温度范围5℃～200℃；移液器：500μL～1000μL；冰箱：0℃～20℃.5试剂与溶液5.1试剂与水所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。5.2羧甲基纤维素酶（CMC）测定试剂与溶液按NY/T912—2004中5.1、5.2、5.3、5.4、5.4、5.6、5.7的规定配制。5.3木聚糖酶测定试剂与溶液按GBT23874—2009中4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7的规定配制。5.4蛋白酶测定试剂与溶液5.4.1碳酸钠溶液(Na2CO3)0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000mL。5.4.2三氯乙酸(CCI3·COOH)0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。5.4.3氢氧化钠溶液(NaOH)0.5mol/L按GB/T601—2016的规定配制。5.4.4盐酸溶液(HCl)1mol/L及0.1mol/L按GB/T601—2016的规定制备配制。5.4.5磷酸缓冲液称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.50g，加水溶解并定容至1000mL，用pH计校正至pH=7.50。5.4.6乳酸缓冲液甲液:称取乳酸(80%～90%)10.60g，加水溶解并定容至1000mL。乙液:称取乳酸钠(70%)16.0g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液8mL，加乙液1mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液，用pH计校正至pH=3.00。5.4.7硼酸缓冲溶液DB41/T1615—20183甲液:称取硼酸钠(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000mL。乙液:称取氢氧化钠4.00g，加水溶解并定容至1000mL。取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL，用pH计校正至pH=10.5。5.4.8l0g/L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。5.4.9l00μg/mLL-酪氨酸标准溶液称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.lmol/L盐酸定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准溶液。5.5漆酶测定试剂与溶液5.5.1乙酸溶液（1mol/L）冰乙酸0.6mL，加水溶解，定容至100mL。5.5.2乙酸钠溶液（1mol/L）称取无水乙酸钠82.0g，加水溶解，定容至1000mL。5.5.3乙酸-乙酸钠缓冲液称取无水乙酸钠8.2g，加入冰乙酸0.85mL，加水溶解，定容至1000mL。用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节pH=5。5.5.40.5mmol/LABTS溶液称取0.2720gABTS试剂，加水溶解，定容至100mL，随用随配。6绘制标准曲线6.1CMC活力标准曲线按NY/T912—2004中第7章的规定绘制标准曲线。6.2木聚糖酶活力标准曲线按GBT23874—2009中第6条的规定绘制标准曲线。6.3蛋白酶活力标准曲线按照表1配制不同浓度的L-络氨酸标准溶液，以标准空白样为对照调零，于275nm处测定其吸光度值A，以L-络氨酸浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线或。根据作图或回归方程计算出当吸光度为1时络氨酸的量（μg），即为吸光常数K（K值应在130～135）。DB41/T1615—20184表1检测方法及步骤管号取100ug/mL络氨酸标准溶液体积/mL水体积/mL络氨酸标准溶液浓度/(ug/mL）0010011910228203373044640555506.4漆酶活力标准曲线按照表2配制不同浓度的ABTS标准溶液浓度，以空白标准样为对照调零，于波长420nm处测定其吸光度值，以ABTS溶液浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。表2ABTS溶液标准溶液的配制管号ABTS试剂重量/mg水体积/mLABTS标准溶液浓度/(mmol/L)001000.015.48681000.1210.97361000.2316.46041000.3421.9471000.4527.4341000.5632.92081000.67酶活力的测试7.1样品的制备液体培养液采用2层纱布过滤取上清液，得到待测酶液。固体原料粉碎，称量50g，加5倍重量去离子水于三角瓶内，重复3份，25℃浸提3h，间隔1h振荡，2层纱布过滤取上清液，得到待测酶液。7.2CMC活力的测定7.2.1酶液的稀释待测培养液用缓冲液稀释10～25倍，测定的OD值为0.5～0.6为宜。7.2.2测定步骤按NY/T912—2004中第9章操作。7.3木聚糖酶活力的测定7.3.1酶液的稀释DB41/T1615—20185按7.2.1的规定操作。7.3.2测定步骤按GB/T23874—2009中第8章的规定操作。7.4蛋白酶活性的测定7.4.1酶液的稀释待测培养液用缓冲液稀释10～50倍，测定的OD值介于0.5～0.6为宜。7.4.2测定步骤取3支具塞试管，一支为空白管，两支为样品管，按表3的测定方法及步骤操作，反应结束后，在分光光度计波长275nm处，分别测定样品空白管和样品管中酶液的吸光度值（A0、A）。表3测定方法及步骤序号反应步骤样品管空白管1加入待测酶液1.0mL1.0mL（水）2预热2min√√3反应底物预热3min√√4加入底物溶液1.0mL1.0mL5混匀√√640℃反应10min√√7加入三氯乙酸终止液2.0mL2.0mL8混匀√√9静止10min√√10过滤√√总体积4.0mL4.0mL注：表中√表示此步骤需要进行。7.4.3结果计算与表示样品中蛋白酶活力以U表示，按式1计算：U=（A-A0）×K×4/10×N×T……………………………（1）式中：U——蛋白酶活力，酶活单位（U/g）或（U/mL）；A——为吸光度值；K——为吸光常数，当吸光度值为1时的酪氨酸的量=103.8；4——反应体积，单位mL;N——稀释倍数；10——反应时间，单位mimT——换算系数，中性、碱性蛋白酶与福林法的转换系数0.5，酸性蛋白酶系数0.77。7.5漆酶活力的测定7.5.1酶液的稀释DB41/T1615—20186待测培养液用缓冲液稀释10～50倍，测定的OD值在0.5～0.6之间为宜。7.5.2测定步骤取3支具塞试管，一支为空白管，两支为样品管，按表4的测定方法及步骤操作，反应结束后，在分光光度计波长420nm处，分别测定样品空白管和样品管中酶液的吸光度值（A0、A）。表4测定方法及步骤序号反应顺序样品管空白管1加入待测酶液0.1mL0.1ml（水）2加入缓冲液1.7mL1.7mL3加入底物溶液0.2mL0.2mL4反应时间6.0min6.0min5加入三氯乙酸0.5mL0.5mL总体积2.5mL2.5mL7.5.3结果计算与表示样品中漆酶活力以U表示，按式2计算：U=（A-A0）/MT×1000×D×60…………………………（2）式中：U——漆酶活力单位，酶活单位（U/g）或（U/mL）；A——粗酶液的吸光度值；1000——mmol与umol的换算系数，1mmol=1000umol；D——稀释倍数；M——ABTS分子量，M=548.68；T——反应时间，单位min；60——换算系数，1min=60s。_________________________________