GB 4789.6-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验

中华人民共和国国家标准GB4789.6—2016食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.6—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T4789.6—2003《食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》。本标准与GB/T4789.6—2003相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验”;———增加了术语和定义、缩略语;———增加了血清学试验中H抗原鉴定;———增加了PCR确认试验;———增加了附录A;———修改了设备和材料;———修改了培养基和试剂;———修改了检验程序;———修改了血清学试验中致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群;———删除了肠毒素试验。GB4789.6—20161食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验1范围本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenicEscherichiacoli)的检验方法。本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验。2术语和定义、缩略语2.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1.1致泻大肠埃希氏菌DiarrheagenicEscherichiacoli一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌,可经过污染食物引起人类发病。常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌(包括肠道出血性大肠埃希氏菌)和肠道集聚性大肠埃希氏菌。2.1.2肠道致病性大肠埃希氏菌EnteropathogenicEscherichiacoli能够引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤,且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌。该菌是婴幼儿腹泻的主要病原菌,有高度传染性,严重者可致死。2.1.3肠道侵袭性大肠埃希氏菌EnteroinvasiveEscherichiacoli能够侵入肠道上皮细胞而引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌。该菌无动力、不发生赖氨酸脱羧反应、不发酵乳糖,生化反应和抗原结构均近似痢疾志贺氏菌。侵入上皮细胞的关键基因是侵袭性质粒上的抗原编码基因及其调控基因,如ipaH基因、ipaR基因(又称为invE基因)。2.1.4产肠毒素大肠埃希氏菌EnterotoxigenicEscherichiacoli能够分泌热稳定性肠毒素或/和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌。该菌可引起婴幼儿和旅游者腹泻,一般呈轻度水样腹泻,也可呈严重的霍乱样症状,低热或不发热。腹泻常为自限性,一般2d~3d即自愈。2.1.5产志贺毒素大肠埃希氏菌Shigatoxin-producingEscherichiacoli(肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichiacoli)能够分泌志贺毒素、引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤的大肠埃希氏菌。有些产志贺毒素大肠埃希氏菌在临床上引起人类出血性结肠炎(HC)或血性腹泻,并可进一步发展为溶血性尿毒综合征(HUS),这类产志贺毒素大肠埃希氏菌为肠道出血性大肠埃希氏菌。GB4789.6—201622.1.6肠道集聚性大肠埃希氏菌EnteroaggregativeEscherichiacoli肠道集聚性大肠埃希氏菌不侵入肠道上皮细胞,但能引起肠道液体蓄积。不产生热稳定性肠毒素或热不稳定性肠毒素,也不产生志贺毒素。唯一特征是能对Hep-2细胞形成集聚性黏附,也称Hep-2细胞黏附性大肠埃希氏菌。2.2缩略语下列缩略语适用于本文件。2.2.1DEC:致泻大肠埃希氏菌DiarrheagenicEscherichiacoli2.2.2EPEC:肠道致病性大肠埃希氏菌EnteropathogenicEscherichiacoli2.2.3EIEC:肠道侵袭性大肠埃希氏菌EnteroinvasiveEscherichiacoli2.2.4ETEC:产肠毒素大肠埃希氏菌EnterotoxigenicEscherichiacoli2.2.5STEC:产志贺毒素大肠埃希氏菌Shigatoxin-producingEscherichiacoli2.2.6EHEC:肠道出血性大肠埃希氏菌EnterohemorrhagicEscherichiacoli2.2.7EAEC:肠道集聚性大肠埃希氏菌EnteroaggregativeEscherichiacoli2.2.8escV:蛋白分泌物调节基因,geneencodingLEE-encodedtypeⅢsecretionsystemfactor2.2.9eae:紧密素基因,geneencodingintiminforEscherichiacoliattachingandeffacing2.2.10bfpB:束状菌毛B基因,bundle-formingpilusB;2.2.11stx1:志贺毒素Ⅰ基因,Shigatoxinone2.2.12stx2:志贺毒素Ⅱ基因,Shigatoxintwo2.2.13lt:热不稳定性肠毒素基因,heat-labileenterotoxin2.2.14st:热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxin2.2.15stp(stIa):猪源热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxinsinitiallydiscoveredintheisolatesfrompigs2.2.16sth(stIb):人源热稳定性肠毒素基因,heat-stableenterotoxinsinitiallydiscoveredintheisolatesfromhuman2.2.17invE:侵袭性质粒调节基因,invasiveplasmidregulator2.2.18ipaH:侵袭性质粒抗原H基因,invasiveplasmidantigenH-gene2.2.19aggR:集聚黏附菌毛调节基因,aggregativeadhesivefimbriaeregulator2.2.20uidA:β-葡萄糖苷酶基因,β-glucuronidasegene2.2.21astA:集聚热稳定性毒素A基因,enteroaggregativeheat-stableenterotoxinA2.2.22pic:肠定植因子基因,proteininvolvedinintestinalcolonization2.2.23LEE:肠细胞损伤基因座,Locusofenterocyteeffacement2.2.24EAF:EPEC黏附因子,EPECadhesivefactor3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。3.2冰箱:2℃~5℃。3.3恒温水浴箱:50℃±1℃,100℃或适配1.5mL或2.0mL金属浴(95℃~100℃)。3.4电子天平:感量为0.1g和0.01g。3.5显微镜:10×~100×。GB4789.6—201633.6均质器。3.7振荡器。3.8无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。3.9无菌均质杯或无菌均质袋:容量500mL。3.10无菌培养皿:直径90mm。3.11pH计或精密pH试纸。3.12微量离心管:1.5mL或2.0mL。3.13接种环:1μL。3.14低温高速离心机:转速≥13000r/min,控温4℃~8℃。3.15微生物鉴定系统。3.16PCR仪。3.17微量移液器及吸头:0.5μL~2μL,2μL~20μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。3.18水平电泳仪:包括电源、电泳槽、制胶槽(长度10cm)和梳子。3.198联排管和8联排盖(平盖/凸盖)。3.20凝胶成像仪。4培养基和试剂4.1营养肉汤:见A.1。4.2肠道菌增菌肉汤:见A.2。4.3麦康凯琼脂(MAC):见A.3。4.4伊红美蓝琼脂(EMB):见A.4。4.5三糖铁(TSI)琼脂:见A.5。4.6蛋白胨水、靛基质试剂:见A.6。4.7半固体琼脂:见A.7。4.8尿素琼脂(pH7.2):见A.8。4.9氰化钾(KCN)培养基:见A.9。4.10氧化酶试剂:见A.10。4.11革兰氏染色液:见A.11。4.12BHI肉汤:见A.12。4.13福尔马林(含38%~40%甲醛)。4.14鉴定试剂盒。4.15大肠埃希氏菌诊断血清。4.16灭菌去离子水。4.170.85%灭菌生理盐水。4.18TE(pH8.0):见A.13。4.1910×PCR反应缓冲液:见A.14。4.2025mmol/LMgCl2。4.21dNTPs:dATP、dTTP、dGTP、dCTP每种浓度为2.5mmol/L。4.225U/LTaq酶。4.23引物。4.2450×TAE电泳缓冲液:见A.15。4.25琼脂糖。GB4789.6—201644.26溴化乙锭(EB)或其他核酸染料。4.276×上样缓冲液:见A.16。4.28Marker:分子量包含100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp条带。4.29致泻大肠埃希氏菌PCR试剂盒。5检验程序致泻大肠埃希氏菌检验程序见图1。图1致泻大肠埃希氏菌检验程序GB4789.6—201656操作步骤6.1样品制备6.1.1固态或半固态样品固体或半固态样品,以无菌操作称取检样25g,加入装有225mL营养肉汤的均质杯中,用旋转刀片式均质器以8000r/min~10000r/min均质1min~2min;或加入装有225mL营养肉汤的均质袋中,用拍击式均质器均质1min~2min。6.1.2液态样品以无菌操作量取检样25mL,加入装有225mL营养肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠),振荡混匀。6.2增菌将6.1制备的样品匀液于36℃±1℃培养6h。取10μL,接种于30mL肠道菌增菌肉汤管内,于42℃±1℃培养18h。6.3分离将增菌液划线接种MAC和EMB琼脂平板,于36℃±1℃培养18h~24h,观察菌落特征。在MAC琼脂平板上,分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色,不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色;在EMB琼脂平板上,分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽,不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色。6.4生化试验6.4.1选取平板上可疑菌落10个~20个(10个以下全选),应挑取乳糖发酵,以及乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落,分别接种TSI斜面。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、尿素琼脂(pH7.2)和KCN肉汤。于36℃±1℃培养18h~24h。6.4.2TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸,靛基质阳性,H2S阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI斜面底层不产酸,或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物,均非大肠埃希氏菌。必要时做革兰氏染色和氧化酶试验。大肠埃希氏菌为革兰氏阴性杆菌,氧化酶阴性。6.4.3如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。6.5PCR确认试验6.5.1取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行PCR确认试验。注:PCR实验室区域设计、工作基本原则及注意事项应参照《疾病预防控制中心建设标准》(建标127—2009)和国家卫生和计划生育委员会(原卫生部)(2010)《医疗机构临床基因扩增管理办法》附录(医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则)。6.5.2使用1μL接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h~24h的菌落,悬浮在200μL0.85%灭菌生理盐水中,充分打散制成菌悬液,于13000r/min离心3min,弃掉上清液。加入1mL灭菌去离子水充分混匀菌体,于100℃水浴或者金属浴维持10min;冰浴冷却后,13000r/min离心3min,收集上清液;按1∶10