GB 4789.16-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 常见产毒霉菌的形态学鉴定

中华人民共和国国家标准GB4789.16—2016食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.16—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T4789.16—2003《食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定》本标准与GB/T4789.16—2003相比,主要修改如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定”;———增加了检验程序;———增加了黑曲霉、炭黑曲霉、棒曲霉、红曲霉等产毒菌种;———修改了标准名称;———修改了设备和材料;———修改了培养基和试剂;———修改了各菌种形态描述;———修改了附录A;———删除了黄绿青霉、岛青霉、皱褶青霉、产紫青霉、红青霉等菌种;———删除检索表原附录B、附录C、附录D。GB4789.16—20161食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定1范围本标准规定了食品中常见产毒真菌的鉴定方法。本标准适用于曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、镰刀菌属(Fusarium)及其他菌属中常见产毒真菌的鉴定。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1冰箱:2℃~5℃。2.2恒温培养箱:25℃±1℃。2.3显微镜:10倍~100倍。2.4目镜测微尺。2.5物镜测微尺。2.6生物安全柜。2.7恒温水浴箱。2.8接种钩。2.9分离针。2.10载玻片。2.11盖玻片。2.12不锈钢小刀或眼科手术小刀。3试剂和培养基3.1乳酸苯酚液:见A.1。3.2查氏培养基:见A.2。3.3马铃薯-葡萄糖琼脂培养基:见A.3。3.4麦芽汁琼脂培养基:见A.4。3.5无糖马铃薯琼脂培养基:见A.5。4操作步骤4.1菌落特征观察:为了培养完整的菌落以供观察记录,可将纯培养物点种于平板上。曲霉、青霉通常接种查氏培养基,镰刀菌通常需要同时接种多种培养基,其他真菌一般使用马铃薯-葡萄糖琼脂培养基。将平板倒转,向上接种一点或三点,每个菌株接种两个平板,正置于25℃±1℃恒温培养箱中进行培GB4789.16—20162养。当刚长出小菌落时,取出一个平皿以无菌操作,用灭菌不锈钢小刀或眼科手术小刀将菌落连同培养基切下1cm×2cm的小块,置菌落一侧,继续培养,于5d~14d进行观察。此法代替小培养法,可观察子实体着生状态。4.2斜面观察:将真菌纯培养物划线接种(曲霉、青霉)或点种(镰刀菌或其菌)于斜面,培养5d~14d,观察菌落形态,同时还可以直接将试管斜面置低倍显微镜下观察孢子的形态和排列。4.3制片:取载玻片加乳酸苯酚液一滴,用接种钩取一小块真菌培养物,置乳酸-苯酚液中,用两支分离针将培养物轻轻撕成小块,切忌涂抹,以免破坏真菌结构。然后加盖玻片,如有气泡,可在酒精灯上加热排除。制片时应在生物安全柜或无菌接种罩或接种箱或手套箱内操作以防孢子飞扬。4.4镜检:观察真菌菌丝和孢子的形态、特征、孢子的排列等,并记录。5检验程序常见产毒霉菌的形态学鉴定检验程序见图1。图1常见产毒霉菌的形态学鉴定检验程序6各属真菌的形态特征及可能产生的真菌毒素6.1曲霉属(Aspergillus)本属的产毒真菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、赭曲霉、黑曲霉、炭黑曲霉和棒曲霉等。这些真菌可能产生黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素、展青霉素等次生代谢产物。曲霉属的菌丝体无色透明或呈明亮的颜色,但不呈暗污色;可育的分生孢梗茎以大体垂直的方向从特化的厚壁的足细胞生出,光滑或粗糙,通常无横隔;顶端膨大形成顶囊,具不同形状,从其表面形成瓶梗,或先产生梗基,再从梗基上形成瓶梗,最后由瓶梗产生分生孢子。分生孢子单胞,具不同形状和各种颜色,光滑或具纹饰,连接成不分枝的链。由顶囊到分生孢子链构成不同形状的分生孢子头,显现不同颜色。有的种可形成厚壁的壳细胞,形状因种而异;有的种则可形成菌核或类菌核结构;还有的种产生有性阶段,形成闭囊壳,内含子囊和子囊孢子,子囊孢子大多透明或具不同颜色、形状和纹饰。6.1.1黄曲霉(A.flavus)菌落在查氏琼脂上生长迅速,25℃7d直径35mm~40mm(~70mm),12d~14d达55mm~GB4789.16—2016370mm;质地主要为致密丝绒状,有时稍现絮状或中央部分呈絮状,平坦或现辐射状至不规则的沟纹;分生孢子结构多,颜色为黄绿至草绿色,初期较淡,老后稍深,大多近于浅水芹绿色(LightCressGreen→CressGreen,R.XXXI),也有呈木犀绿色(MignonetteGreen,R.XXXI),暗草绿色(Kronberg’sGreen,R.XXXI)或翡翠绿色(JadeGreen,R.XXXI)者,有的菌株初期现黄色,近于锶黄(StrontiumYellow,R.XVI),而后变绿;一般无渗出液;有的菌株形成少量或大量菌核,大量时,影响菌落外观,伴随有渗出液,无色至淡褐色,菌落反面无色至淡褐色,产生菌核的菌株,在形成菌核处的反面显现黑褐色斑点。分生孢子头初为球形,后呈辐射形,(80~)200~500(~800)μm,或裂成几个疏松的柱状体,也有少数呈短柱状者;分生孢子梗大多生自基质,孢梗茎(200~)400~800(~3000)μm×(4~)9.6~16(~20)μm,壁厚,无色,粗糙至很粗糙;顶囊近球形至烧瓶形,直径(9~)23~50(~65)μm,大部表面可育,小者仅上部可育;产孢结构双层:梗基6.2~13.2(19~)×3.2μm×6μm,瓶梗6.2~12μm×2.4~4μm,有的小顶囊只生瓶梗;分生孢子多为球形或近球形(2.4~)3.6~4.8(~6.4)μm,少数呈椭圆形3.2~5.2μm×2.7~4.2μm,壁稍粗糙至具小刺;有的菌株产生菌核,初为白色,老后呈褐黑色,球形或近球形,大小或数量各异,一般为(280~)420~980μm,见图2。黄曲霉的某些菌株可产生黄曲霉毒素(Aflatoxins)。图2黄曲霉的产孢结构和分生孢子6.1.2寄生曲霉(A.parasiticus)菌落在查氏琼脂上25℃7d直径35mm,12d~14d50mm~60mm;质地丝绒状,偶有絮状菌丝,边缘白色;分生孢子结构多,颜色为深绿色,近于雪松绿(CedarGreen,R.VI),老后变暗近于常春藤绿(IvyGreen,R.XXXI);有辐射状沟纹,无渗出液,菌落反面呈淡褐色,近于浅灰褐色(LightDrab,R.VLVI)。分生孢子头初为球形,后呈辐射形,直径84μm~210μm;分生孢子梗生自基质,孢梗茎140~420(~800)μm×6~12μm,壁现粗糙,也有近于光滑者;顶囊为杵形或烧瓶形,直径(13.8~)17~31μm,大部表面可育;产孢结构单层,瓶梗6.2~10.6μm×2.4~4μm,偶尔可观察到较长者可达15μm,中间具一隔壁;分生孢子球形或近球形,(3.6~)4.2~5.5(~6.4)μm,壁稍粗糙,具粗硫小刺;未见菌核,见图3。寄生曲霉的菌株都能产生黄曲霉毒素。GB4789.16—20164图3寄生曲霉的产孢结构和分生孢子6.1.3杂色曲霉(A.versicolor)菌落在查氏琼脂上生长局限,25℃7d直径15mm~17mm,10d~12d达24mm~30mm;质地为丝绒状或絮状,或两种质地并存或相互镶嵌;菌落不平,稍厚,中央部分隆起或凹陷,或呈不同程度的翘曲;颜色差异很大,初为白色,后呈不同程度的绿色,近于青豆绿、阿福花绿(PoisGreen,AsphodelGreen,R.XLI)至深葡萄绿(DeepGrapeGreen,R.XLI),有的菌株呈孔雀绿(MalachiteGreen,R.XXXⅡ),橄榄绿(OliveGreen,R.Ⅳ)或暗橄榄褐色(DarkOliveBuff,R.XL),间或有不呈绿色者,取决于分生孢子结构的多少;菌丝体呈黄褐色、粉红色,近于浅褐粉红色(BuffyPink,R.XXLⅢ)或淡粉红肉桂色(PalePinkishCinnamrn,R.XXIX),因不同菌株而异;分生孢子结构有时形成迟缓;有辐射状沟纹;渗出液有或无,近于无色或呈淡褐色至紫红色,形成小滴或聚成大滴;无明显气味或稍具霉味;菌落反面颜色不一,近于无色至淡黄褐色、粉红色、玫瑰紫色或紫褐色,色素扩散于基质;有的菌株形成壳细胞,老培养物中可见聚成淡黄色的团块。分生孢子头较小,初为球形,后呈辐射形,直径(25~)75~125μm;分生孢梗茎直接生自基质者(45~)150~300(~500)μm×4~8μm,生自气生菌丝者大都很短,无色或稍带黄色,壁较厚,光滑;顶囊半球形、稍长形或稍呈椭圆形,直径9~20μm,约3/4的表面可育,小顶囊仅分生孢梗茎顶部稍加膨大而不明显;产孢结构双层:梗基一般5~8μm×2~3μm,瓶梗6~8μm×1.5~2.5μm;分生孢子球形或近球形,绿色,直径(2~)2.5~3.5(~4)μm,壁粗糙,具小刺;壳细胞球形或近球形,直径11μm~20μm,大量形成时聚成淡黄色的团块,见图4。杂色曲霉的某些菌株可产生杂色曲霉素(sterigmatocystin)。GB4789.16—20165说明:1,4———产孢结构;2———不完整的产孢结构;3,5———分生孢子;6———壳细胞。图4杂色曲霉的产孢结构、分生孢子和壳细胞6.1.4构巢裸胞壳(Emericellanidulans)无性型:构巢曲霉(A.nidulans)菌落在查氏琼脂上25℃7d直径25mm左右,12d~14d45mm~65mm;质地丝绒状或絮状,平坦或具不明显的放射沟纹;分生孢子结构大量或较少,呈不同程度的绿色,近于翡翠绿至水芹绿(JadeGreen→CressGreen,R.XXXI)或林肯绿至阿福花绿(LincolnGreen→AsphodelGreen,R.XLI)乃至浅黄橄榄色(LightYellowishOlive,R.XXX);有部分闭囊壳散在其间,有的菌株产生大量的闭囊壳,由壳细胞所包围,使表面显现黄色团块或絮状颗粒结构,使菌落带黄褐色,近于鹿褐色、浅黄褐色或古铜色(FawnColor,BuffyBrown,R.XL;IsabellaColor,R.XXX);渗出液多、少或无,呈淡红褐至紫褐色;无气味;菌落反面淡紫褐色至紫褐色,近于葡萄酒鹿褐色(VinaceousFawn,R.XL),稍扩散于基质。闭囊壳球形,暗紫红色,直径100~250(~300)μm,外面由壳细胞所包围而呈现淡黄色;子囊近球形,8~12μm,一般在二周内成熟,有的则不成熟;子囊孢子双凸镜形,3.5~5μm×3.2~4μm,具两个完整的赤道冠,具褶,宽约0.5~1μm,紫红色,凸面光滑。分生孢子头初为球形至放射形,直径30~70μm,老后呈致密短柱形,50~100μm×30~40μm;分生孢子梗生自基质或气生菌丝,孢梗茎大多较短,(20~)50~150(~300)μm×3.5~6.5μm,稍弯曲,带茶褐色,壁光滑;顶囊为半球形,颜色与孢梗茎相同,直径(5.5~)8~16μm,上半部表面可育;产孢结构双层:梗基4~8μm×2.5~3μm,有的异常菌株在顶囊上形成肥大的近于球形的梗基,瓶梗5~8μm×2~2.5μm;分生孢子球形(2.5~)3~4(~4.5)μm,粗糙,偶而近于光滑;壳细胞大多为球形,直径11μm~25μm,少数稍长或椭圆形18~40μm×12~24μm,见图5。构巢曲霉的某些菌株可产生杂色曲霉素。GB4789.16—20166说明:1———产孢结构;2———分生孢子;3———子囊孢子;4———壳细胞。图5构巢裸胞壳的产孢结构6.1.5赭曲霉(A.ochraceus)菌落在查氏琼脂上25℃7d直径25mm~35mm,10d~12d达35mm~55mm;质地丝绒状或稍现絮状,平坦或具不明显的辐射状沟纹;分生孢子结构稠密或较稀疏,淡黄褐色,近于鹿皮色至肉桂色(Chamois,R.XXX→C