GB 5009.22-2016 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定

书书书!#$%&’’()*犌犅５００９．２２—２０１６!#$%&’(!)*+,-.犅/0犌/123２０１６１２２３45２０１７０６２３67!#$%&’’(+,&-.,/012’(34546789:;45书书书犌犅５００９．２２—２０１６Ⅰ　　　　前　　言　　本标准代替ＧＢ／Ｔ５００９．２２—２００３《食品中黄曲霉毒素Ｂ１的测定》、ＧＢ／Ｔ５００９．２３—２００６《食品中黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２的测定》、ＧＢ５００９．２４—２０１０《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素Ｍ１和Ｂ１的测定》、ＧＢ／Ｔ２３２１２—２００８《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１、Ｍ２的测定　液相色谱荧光检测法》、ＧＢ／Ｔ１８９７９—２００３《食品中黄曲霉毒素的测定　免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》、ＳＮ０３３９—１９９５《出口茶叶中黄曲霉毒素Ｂ１检验方法》、ＳＮ／Ｔ１６６４—２００５《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素Ｍ１、Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２含量的测定》、ＳＮ／Ｔ１１０１—２００２《进出口油籽及粮谷中黄曲霉毒素的检验方法》、ＳＮ０６３７—１９９７《出口油籽、坚果及坚果制品中黄曲霉毒素的检验方法　液相色谱法》、ＳＮ／Ｔ１７３６—２００６《进出口蜂蜜中黄曲霉毒素的检验方法　高效液相色谱法》、ＮＹ／Ｔ１２８６—２００７《花生黄曲霉毒素Ｂ１的测定　高效液相色谱法》。本标准与ＧＢ／Ｔ５００９．２２—２００３相比，主要变化如下：———标准名称修改为“食品安全国家标准　食品中黄曲霉毒素Ｂ族和Ｇ族的测定”；———根据ＧＢ２７６１—２０１１的要求，增加了方法的适用范围；———增加了同位素稀释液相色谱串联质谱法为第一法；———增加了高效液相色谱柱前衍生法为第二法；———增加了高效液相色谱柱后衍生法为第三法；———修改了酶联免疫法，并将方法名称更改为酶联免疫吸附筛查法；———增加了免疫亲和柱以及酶联免疫试剂盒质量判定要求与方法；———修改了测定组分为黄曲霉毒素Ｂ族和Ｇ族化合物。犌犅５００９．２２—２０１６１　　　　食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素犅族和犌族的测定１　范围本标准规定了食品中黄曲霉毒素Ｂ１、黄曲霉毒素Ｂ２、黄曲霉毒素Ｇ１、黄曲霉毒素Ｇ２（以下简称ＡＦＴＢ１、ＡＦＴＢ２、ＡＦＴＧ１和ＡＦＴＧ２）的测定方法。本标准第一法为同位素稀释液相色谱串联质谱法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中ＡＦＴＢ１、ＡＦＴＢ２、ＡＦＴＧ１和ＡＦＴＧ２的测定。本标准第二法为高效液相色谱柱前衍生法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中ＡＦＴＢ１、ＡＦＴＢ２、ＡＦＴＧ１和ＡＦＴＧ２的测定。本标准第三法为高效液相色谱柱后衍生法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中ＡＦＴＢ１、ＡＦＴＢ２、ＡＦＴＧ１和ＡＦＴＧ２的测定。本标准第四法为酶联免疫吸附筛查法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中ＡＦＴＢ１的测定。本标准第五法为薄层色谱法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品中ＡＦＴＢ１的测定。第一法　同位素稀释液相色谱串联质谱法２　原理试样中的黄曲霉毒素Ｂ１、黄曲霉毒素Ｂ２、黄曲霉毒素Ｇ１、黄曲霉毒素Ｇ２，用乙腈水溶液或甲醇水溶液提取，提取液用含１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（或吐温２０）的磷酸盐缓冲溶液稀释后（必要时经黄曲霉毒素固相净化柱初步净化），通过免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。３　试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。３．１　试剂３．１．１　乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱纯。３．１．２　甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色谱纯。３．１．３　乙酸铵（ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）：色谱纯。３．１．４　氯化钠（ＮａＣｌ）。犌犅５００９．２２—２０１６２　　　　３．１．５　磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）。３．１．６　磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）。３．１．７　氯化钾（ＫＣｌ）。３．１．８　盐酸（ＨＣｌ）。３．１．９　ＴｒｉｔｏｎＸ１００［Ｃ１４Ｈ２２Ｏ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）狀］（或吐温２０，Ｃ５８Ｈ１１４Ｏ２６）。３．２　试剂配制３．２．１　乙酸铵溶液（５ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取０．３９ｇ乙酸铵，用水溶解后稀释至１０００ｍＬ，混匀。３．２．２　乙腈水溶液（８４＋１６）：取８４０ｍＬ乙腈加入１６０ｍＬ水，混匀。３．２．３　甲醇水溶液（７０＋３０）：取７００ｍＬ甲醇加入３００ｍＬ水，混匀。３．２．４　乙腈水溶液（５０＋５０）：取５０ｍＬ乙腈加入５０ｍＬ水，混匀。３．２．５　乙腈甲醇溶液（５０＋５０）：取５０ｍＬ乙腈加入５０ｍＬ甲醇，混匀。３．２．６　１０％盐酸溶液：取１ｍＬ盐酸，用纯水稀释至１０ｍＬ，混匀。３．２．７　磷酸盐缓冲溶液（以下简称ＰＢＳ）：称取８．００ｇ氯化钠、１．２０ｇ磷酸氢二钠（或２．９２ｇ十二水磷酸氢二钠）、０．２０ｇ磷酸二氢钾、０．２０ｇ氯化钾，用９００ｍＬ水溶解，用盐酸调节ｐＨ至７．４±０．１，加水稀释至１０００ｍＬ。３．２．８　１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（或吐温２０）的ＰＢＳ：取１０ｍＬＴｒｉｔｏｎＸ１００（或吐温２０），用ＰＢＳ稀释至１０００ｍＬ。３．３　标准品３．３．１　ＡＦＴＢ１标准品（Ｃ１７Ｈ１２Ｏ６，ＣＡＳ：１１６２６５８）：纯度≥９８％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．２　ＡＦＴＢ２标准品（Ｃ１７Ｈ１４Ｏ６，ＣＡＳ：７２２０８１７）：纯度≥９８％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．３　ＡＦＴＧ１标准品（Ｃ１７Ｈ１２Ｏ７，ＣＡＳ：１１６５３９５）：纯度≥９８％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．４　ＡＦＴＧ２标准品（Ｃ１７Ｈ１４Ｏ７，ＣＡＳ：７２４１９８７）：纯度≥９８％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。３．３．５　同位素内标１３Ｃ１７ＡＦＴＢ１（Ｃ１７Ｈ１２Ｏ６，ＣＡＳ：１２１７４４９４５０）：纯度≥９８％，浓度为０．５μｇ／ｍＬ。３．３．６　同位素内标１３Ｃ１７ＡＦＴＢ２（Ｃ１７Ｈ１４Ｏ６，ＣＡＳ：１２１７４７０９８８）：纯度≥９８％，浓度为０．５μｇ／ｍＬ。３．３．７　同位素内标１３Ｃ１７ＡＦＴＧ１（Ｃ１７Ｈ１２Ｏ７，ＣＡＳ：１２１７４４４０７９）：纯度≥９８％，浓度为０．５μｇ／ｍＬ。３．３．８　同位素内标１３Ｃ１７ＡＦＴＧ２（Ｃ１７Ｈ１４Ｏ７，ＣＡＳ：１２１７４６２４９１）：纯度≥９８％，浓度为０．５μｇ／ｍＬ。注：标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液。３．４　标准溶液配制３．４．１　标准储备溶液（１０μｇ／ｍＬ）：分别称取ＡＦＴＢ１、ＡＦＴＢ２、ＡＦＴＧ１和ＡＦＴＧ２１ｍｇ（精确至０．０１ｍｇ），用乙腈溶解并定容至１００ｍＬ。此溶液浓度约为１０μｇ／ｍＬ。溶液转移至试剂瓶中后，在－２０℃下避光保存，备用。临用前进行浓度校准（校准方法参见附录Ａ）。３．４．２　混合标准工作液（１００ｎｇ／ｍＬ）：准确移取混合标准储备溶液（１．０μｇ／ｍＬ）１．００ｍＬ至１００ｍＬ容量瓶中，乙腈定容。此溶液密封后避光－２０℃下保存，三个月有效。３．４．３　混合同位素内标工作液（１００ｎｇ／ｍＬ）：准确移取０．５μｇ／ｍＬ１３Ｃ１７ＡＦＴＢ１、１３Ｃ１７ＡＦＴＢ２、１３Ｃ１７ＡＦＴＧ１和１３Ｃ１７ＡＦＴＧ２各２．００ｍＬ，用乙腈定容至１０ｍＬ。在－２０℃下避光保存，备用。３．４．４　标准系列工作溶液：准确移取混合标准工作液（１００ｎｇ／ｍＬ）１０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、５００μＬ、８００μＬ、１０００μＬ至１０ｍＬ容量瓶中，加入２００μＬ１００ｎｇ／ｍＬ的同位素内标工作液，用初始流动相定容至刻度，配制浓度点为０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１．０ｎｇ／ｍＬ、２．０ｎｇ／ｍＬ、５．０ｎｇ／ｍＬ、８．０ｎｇ／ｍＬ、犌犅５００９．２２—２０１６３　　　　１０．０ｎｇ／ｍＬ的系列标准溶液。４　仪器和设备４．１　匀浆机。４．２　高速粉碎机。４．３　组织捣碎机。４．４　超声波／涡旋振荡器或摇床。４．５　天平：感量０．０１ｇ和０．００００１ｇ。４．６　涡旋混合器。４．７　高速均质器：转速６５００ｒ／ｍｉｎ～２４０００ｒ／ｍｉｎ。４．８　离心机：转速≥６０００ｒ／ｍｉｎ。４．９　玻璃纤维滤纸：快速、高载量、液体中颗粒保留１．６μｍ。４．１０　固相萃取装置（带真空泵）。４．１１　氮吹仪。４．１２　液相色谱串联质谱仪：带电喷雾离子源。４．１３　液相色谱柱。４．１４　免疫亲和柱：ＡＦＴＢ１柱容量≥２００ｎｇ，ＡＦＴＢ１柱回收率≥８０％，ＡＦＴＧ２的交叉反应率≥８０％（验证方法参见附录Ｂ）。注：对于不同批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。４．１５　黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱或功能相当的固相萃取柱（以下简称净化柱）：对复杂基质样品测定时使用。４．１６　微孔滤头：带０．２２μｍ微孔滤膜（所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象，方可使用）。４．１７　筛网：１ｍｍ～２ｍｍ试验筛孔径。４．１８　ｐＨ计。５　分析步骤使用不同厂商的免疫亲和柱，在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能会略有不同，应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作。警示：整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光（直射阳光）、具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中，操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。５．１　样品制备５．１．１　液体样品（植物油、酱油、醋等）采样量需大于１Ｌ，对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集３个包装（同一批次或号），将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后，其中任意的１００ｇ（ｍＬ）样品进行检测。５．１．２　固体样品（谷物及其制品、坚果及籽类、婴幼儿谷类辅助食品等）采样量需大于１ｋｇ，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于２ｍｍ孔径试验筛，混合均匀后缩分至１００ｇ，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。５．１．３　半流体（腐乳、豆豉等）采样量需大于１ｋｇ（Ｌ），对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集３个包装（同一批次或号），用组织犌犅５００９．２２—２０１６４　　　　捣碎机捣碎混匀后，储存于样品瓶中，密封保存，供检测用。５．２　样品提取５．２．１　液体样品５．２．１．１　植物油脂称取５ｇ试样（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入１００μＬ同位素内标工作液（３．４．３）振荡混合后静置３０ｍｉｎ。加入２０ｍＬ乙腈水溶液（８４＋１６）或甲醇水溶液（７０＋３０），涡旋混匀，置于超声波／涡旋振荡器或摇床中振荡２０ｍｉｎ（或用均质器均质３ｍｉｎ），在６０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，取上清液备用。５．２．１．２　酱油、醋称取５ｇ试样（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入１２５μＬ同位素内标工作液振荡混合后静置３０ｍｉｎ。用乙腈或甲醇定容至２５ｍＬ（精确至０．１ｍＬ），涡旋混匀，置于超声波／涡旋振荡器或摇床中振荡２０ｍｉｎ（或用均质器均质３ｍｉｎ），在６０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ（或均质后玻璃纤维滤纸过滤），取上清液备用。５．２．２　固体样品５．２．２．１　一般固体样品称取５ｇ试样（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入１００μＬ同位素内标工作液振荡混合后静置３０ｍｉｎ。加入２０．０ｍＬ乙腈水溶液（８４＋１６）或甲醇水溶液（７０＋３０），涡旋混匀，置于超声波／涡旋振荡器或摇床中振荡２０ｍｉｎ（或用均质器均质３ｍｉｎ），在６０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ（或均质后玻璃纤维滤纸过滤），取上清液备用。５．２．２．２　婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品称取５ｇ试样（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入１００μＬ同位素内标