GB 5009.24-2016 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.24—2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB5009.24—20161前言本标准代替GB5413.37—2010《食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定》、GB5009.24—2010《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定》、GB/T23212—2008《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定高效液相色谱法-荧光检测法》和SN/T1664—2005《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2含量的测定》。本标准与GB5413.37—2010相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定”;———增加了方法适用范围;———增加了对黄曲霉毒素M2的检测;———修改了酶联免疫法,并修改第三法名称为酶联免疫吸附筛查法;———修改了液相色谱-质谱联用法;———修改了液相色谱法的前处理方法;———删除了免疫层析净化荧光分光度法。GB5009.24—20162食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定1范围本标准规定了食品中黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2(以下简称AFTM1和AFTM2)的测定方法。第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法,适用于乳、乳制品和含乳特殊膳食用食品中AFTM1和AFTM2的测定。第二法为高效液相色谱法,适用范围同第一法。第三法为酶联免疫吸附筛查法,适用于乳、乳制品和含乳特殊膳食用食品中AFTM1的筛查测定。第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法2原理试样中的黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素M2用甲醇-水溶液提取,上清液用水或磷酸盐缓冲液稀释后,经免疫亲和柱净化和富集,净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离,串联质谱检测,同位素内标法定量。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1乙腈(CH3CN):色谱纯。3.1.2甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.3乙酸铵(CH3COONH4)。3.1.4氯化钠(NaCl)。3.1.5磷酸氢二钠(Na2HPO4)。3.1.6磷酸二氢钾(KH2PO4)。3.1.7氯化钾(KCl)。3.1.8盐酸(HCl)。3.1.9石油醚(CnH2n+2):沸程为30℃~60℃。3.2试剂配制3.2.1乙酸铵溶液(5mmol/L):称取0.39g乙酸铵,溶于1000mL水中,混匀。3.2.2乙腈-水溶液(25+75):量取250mL乙腈加入750mL水中,混匀。3.2.3乙腈-甲醇溶液(50+50):量取500mL乙腈加入500mL甲醇中,混匀。GB5009.24—201633.2.4磷酸盐缓冲溶液(以下简称PBS):称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠(或2.92g十二水磷酸氢二钠)、0.20g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾,用900mL水溶解后,用盐酸调节pH至7.4,再加水至1000mL。3.3标准品3.3.1AFTM1标准品(C17H12O7,CAS:6795-23-9):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.2AFTM2标准品(C17H14O7,CAS:6885-57-0):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.3.313C17-AFTM1同位素溶液(13C17H14O7):0.5μg/mL。3.4标准溶液配制3.4.1标准储备溶液(10μg/mL):分别称取AFTM1和AFTM21mg(精确至0.01mg),分别用乙腈溶解并定容至100mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中,在-20℃下避光密封保存。临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)。3.4.2混合标准储备溶液(1.0μg/mL):分别准确吸取10μg/mLAFTM1和AFTM2标准储备液1.00mL于同一10mL容量瓶中,加乙腈稀释至刻度,得到1.0μg/mL的混合标准液。此溶液密封后避光4℃保存,有效期3个月。3.4.3混合标准工作液(100ng/mL):准确吸取混合标准储备溶液(1.0μg/mL)1.00mL至10mL容量瓶中,乙腈定容。此溶液密封后避光4℃下保存,有效期3个月。3.4.450ng/mL同位素内标工作液1(13C17-AFTM1):取AFTM1同位素内标(0.5μg/mL)1mL,用乙腈稀释至10mL。在-20℃下保存,供测定液体样品时使用。有效期3个月。3.4.55ng/mL同位素内标工作液2(13C17-AFTM1):取AFTM1同位素内标(0.5μg/mL)100μL,用乙腈稀释至10mL。在-20℃下保存,供测定固体样品时使用。有效期3个月。3.4.6标准系列工作溶液:分别准确吸取标准工作液5μL、10μL、50μL、100μL、200μL、500μL至10mL容量瓶中,加入100μL50ng/mL的同位素内标工作液,用初始流动相定容至刻度,配制AFTM1和AFTM2的浓度均为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的系列标准溶液。4仪器和设备4.1天平:感量0.01g、0.001g和0.00001g。4.2水浴锅:温控50℃±2℃。4.3涡旋混合器。4.4超声波清洗器。4.5离心机:≥6000r/min。4.6旋转蒸发仪。4.7固相萃取装置(带真空泵)。4.8氮吹仪。4.9液相色谱-串联质谱仪:带电喷雾离子源。4.10圆孔筛:1mm~2mm孔径。4.11玻璃纤维滤纸:快速,高载量,液体中颗粒保留1.6μm。4.12一次性微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可GB5009.24—20164使用)。4.13免疫亲和柱:柱容量≥100ng(柱容量、回收率、柱回收率验证方法参见附录B)。注:对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。5分析步骤使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品的上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同,应该按照供应商所提供的操作说明书要求进行操作。警示:整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光(直射阳光),具备相对独立的操作台和废弃物存放装置。在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。5.1样品提取5.1.1液态乳、酸奶称取4g混合均匀的试样(精确到0.001g)于50mL离心管中,加入100μL13C17-AFTM1内标溶液(5ng/mL)振荡混匀后静置30min,加入10mL甲醇,涡旋3min。置于4℃、6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤,将适量上清液或滤液转移至烧杯中,加40mL水或PBS稀释,备用。5.1.2乳粉、特殊膳食用食品称取1g样品(精确到0.001g)于50mL离心管中,加入100μL13C17-AFTM1内标溶液(5ng/mL)振荡混匀后静置30min,加入4mL50℃热水,涡旋混匀。如果乳粉不能完全溶解,将离心管置于50℃的水浴中,将乳粉完全溶解后取出。待样液冷却至20℃后,加入10mL甲醇,涡旋3min。置于4℃、6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤,将适量上清液或滤液转移至烧杯中,加40mL水或PBS稀释,备用。5.1.3奶油称取1g样品(精确到0.001g)于50mL离心管中,加入100μL13C17-AFTM1内标溶液(5ng/mL)振荡混匀后静置30min,加入8mL石油醚,待奶油溶解,再加9mL水和11mL甲醇,振荡30min,将全部液体移至分液漏斗中。加入0.3g氯化钠充分摇动溶解,静置分层后,将下层移到圆底烧瓶中,旋转蒸发至10mL以下,用PBS稀释至30mL。5.1.4奶酪称取1g已切细、过孔径1mm~2mm圆孔筛混匀样品(精确到0.001g)于50mL离心管中,加100μL13C17-AFTM1内标溶液(5ng/mL)振荡混匀后静置30min,加入1mL水和18mL甲醇,振荡30min,置于4℃、6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤,将适量上清液或滤液转移至圆底烧瓶中,旋转蒸发至2mL以下,用PBS稀释至30mL。5.2净化5.2.1免疫亲和柱的准备将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。5.2.2净化免疫亲和柱内的液体放弃后,将上述样液移至50mL注射器筒中,调节下滴流速为1mL/min~GB5009.24—201653mL/min。待样液滴完后,往注射器筒内加入10mL水,以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统,在亲和柱下放置10mL刻度试管,取下50mL的注射器筒,加入2×2mL乙腈(或甲醇)洗脱亲和柱,控制1mL/min~3mL/min下滴速度,用真空泵抽干亲和柱,收集全部洗脱液至刻度试管中。在50℃下氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,用初始流动相定容至1.0mL,涡旋30s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。注:全自动(在线)或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。为防止黄曲霉毒素M破坏,相关操作在避光(直射阳光)条件下进行。5.3液相色谱参考条件液相色谱参考条件列出如下:a)液相色谱柱:C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm,填料粒径1.7μm),或相当者。b)色谱柱柱温:40℃。c)流动相:A相,5mmol/L乙酸铵水溶液;B相,乙腈-甲醇(50+50)。梯度洗脱:参见表1。d)流速:0.3mL/min。e)进样体积:10μL。5.4质谱参考条件质谱参考条件列出如下:a)检测方式:多离子反应监测(MRM);b)离子源控制条件:参见表2;c)离子选择参数:见表3;d)液相色谱-质谱图和子离子扫描图:见附录C。表1液相色谱梯度洗脱条件时间/min流动相A/%流动相B/%梯度变化曲线0.068.032.0—0.568.032.014.255.045.065.00.0100.065.70.0100.016.068.032.06表2离子源控制条件电离方式ESI+毛细管电压/kV17.5锥孔电压/V45射频透镜1电压/V12.5射频透镜2电压/V12.5GB5009.24—20166表2(续)离子源温度/℃120锥孔反吹气流量/(L/h)50脱溶剂气温度/℃350脱溶剂气流量/(L/h)500电子倍增电压/V650表3质谱条件参数化合物名称母离子(m/z)定量子离子(m/z)碰撞能量eV定性子离子(m/z)碰撞能量eV离子化方式AFTM13292732325923ESI+13C-AFTM13463172328824ESI+AFTM23312752326122ESI+5.5定性测定试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,变化范围应在±2.5%之内。每种化合物的质谱定性离子必须出现,至少应包括一个母离子和两个子离子,而且同一检测批次,对同一化合物,样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比,其允许偏差不超过表4规定的范围。表4定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%5020~5010~20≤10允许相对偏差/%±20±25±30±505.6标准曲线的制作在5.3、5.4液相色谱-串联质谱仪分析条件下,将标准系列溶液由低到高浓度进样检测,以AFTM1和AFTM2色谱峰与内标色谱峰13C17-AFTM1的峰面积比值-浓度作图,得到标准曲线回归方程,其线性相关系数应大于0.99。5.7试样溶液的测定取5.2下处理得到的待测溶液进样,内标法计算待测液中目标物质的质量浓度,按第6章计算样品中待测物的含量。5.8空白试验不称取试样,按5.1和5.2的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。GB5009.24—201676分析结果的表述试样中AFTM1或AFTM2的残留量按式(1)计算:X=ρ×V×f×1000m×1000…………………………(1)式中:X———试样中AF