GB 5009.198-2016 食品安全国家标准 贝类中失忆性贝类毒素的测定

中华人民共和国国家标准GB5009.198—2016食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB5009.198—2016Ⅰ前言本标准代替GB/T5009.198—2003《贝类记忆丧失性贝类毒素软骨藻酸的测定》、SN/T1070—2002《进出口贝类中记忆丧失性贝类毒素检验方法》、SN/T1867—2007《进出口贝类中软骨藻酸的检测方法液相色谱-串联质谱法》、SN/T2663—2010《贝类中失忆性贝类毒素检验方法酶联免疫吸附法》。本标准与GB/T5009.198—2003相比,主要变化如下:———标准名称修改为“食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定”;———修改了固相萃取条件;———改变了流动相;———增加了酶联免疫吸附法;———增加了液相色谱-串联质谱法。GB5009.198—20161食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定1范围本标准规定了贝类中失忆性贝类毒素测定的酶联免疫吸附法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。本标准中酶联免疫吸附法适用于贝类及其制品中失忆性贝类毒素的测定,液相色谱法和液相色谱-串联质谱法适用于贝类及其制品(不包括盐渍制品)中失忆性贝类毒素软骨藻酸(DA)的测定。酶联免疫吸附法2原理本方法测定基础是竞争性酶联免疫反应,酶标板上包被有针对软骨藻酸抗体的捕捉抗体,加入抗软骨藻酸抗体、标准液或样品溶液及软骨藻酸酶标记物,游离的失忆性贝类毒素与软骨藻酸酶标记物竞争软骨藻酸抗体,同时软骨藻酸抗体与捕捉抗体连接。没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质和显色剂加入到微孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm测量微孔溶液的吸光度值,试样中失忆性贝类毒素的含量与吸光度值成反比,按绘制的标准曲线定量计算。3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.1甲醇(CH3OH)。3.1.2十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)。3.1.3氯化钠(NaCl)。3.1.4氯化钾(KCl)。3.1.5磷酸二氢钾(KH2PO4)。3.1.6吐温-20(C58H114O26)。3.1.7抗DA抗体。3.1.8牛血清白蛋白(BSA)。3.1.9DA酶标记物。3.1.10过氧化氢(H2O2)。3.1.113,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB,C16H20N2)。3.1.12硫酸(H2SO4)。GB5009.198—201623.2试剂配制3.2.1PBS溶液(pH7.4):分别称取磷酸二氢钾0.20g、十二水合磷酸氢二钠2.90g、氯化钠8.00g、氯化钾0.20g,加水溶解并定容至1000mL。3.2.2抗体稀释液:称取1.0gBSA,加PBS溶液(pH7.4)溶解并定容至1000mL。3.2.3抗DA抗体工作液:抗DA抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度。3.2.4DA酶标记物工作液:用抗体稀释液将DA酶标记物稀释至工作浓度。3.2.5洗脱液:吸取0.5mL吐温-20,用PBS溶液(pH7.4)稀释至1000mL。3.2.6硫酸溶液(6mol/L):吸取319.2mL硫酸,缓缓加至600mL水中,并用水稀释至1000mL。3.3标准品软骨藻酸(DA,C15H21NO6,CAS号14277-97-5)标准溶液。3.4标准溶液配制DA标准系列工作液:准确吸取适量DA标准溶液用PBS溶液稀释并定容,配制成质量浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL和10.0ng/mL的DA标准系列工作液。现用现配。3.5材料3.5.1包被有DA捕捉抗体的微孔板。注:商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准,参见附录A。3.5.2水相微孔滤膜:0.45μm。4仪器和设备4.1酶标仪。4.2天平:感量为0.01g。4.3均质器。4.4离心机:转速≥6000r/min。5分析步骤5.1样品采集至少采集10个贝类样品,并使贝肉达200g以上。冷冻样品置于保温盒中冷冻送检,或保证其处于低温状态(0℃~10℃)送检。如为带壳样品,应开壳,去除水分后冷冻送检。5.2试样制备5.2.1生鲜带壳样品用清水将贝类样品外表彻底洗净,切断闭壳肌,开壳,用水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开,取出贝肉,切勿割破肉体。开壳前不要加热或用麻醉剂。收集100g贝肉置于孔径约2mm的金属筛网上,沥水5min,检出碎壳等杂物,将贝肉均质,备用。GB5009.198—201635.2.2冷冻样品在室温下,使冷冻样品呈半冷冻状态。带壳冷冻样品,按5.2.1方法清洗、开壳、淋洗取肉,除去贝肉外部附着的冰片,抹去水分,室温缓化。将100g解冻的贝肉均质,备用。5.2.3贝类罐头将贝类罐头内容物沥干水分,充分均质,备用。5.2.4贝肉干制品称取100g贝肉干制品放入一定量水中浸泡24h~48h(4℃冷藏),沥干、均质、备用。5.2.5盐渍制品用清水洗涤,流水脱盐,沥干,均质,备用。5.3试样提取称取10g(精确至0.01g)试样,加入10mL水,涡旋振荡1min,加入20mL甲醇,涡旋振荡1min,6000r/min离心10min,移取上清液,用0.45μm的水相微孔滤膜过滤,得到试样提取液,用PBS溶液(pH7.4)稀释100倍,得到试样稀释液。吸取50μL试样稀释液进行测定。5.4测定将已包被捕捉抗体的微孔条插入微孔架并做好标记,其中包括空白对照孔、标准液孔和样液孔,分别做平行孔。向空白对照孔加入150μLPBS溶液(pH7.4),向标准液孔加入50μL失忆性贝类毒素标准系列工作液,向样液孔加入50μL样液。向上述所有微孔中加入100μLDA酶标记物工作液,轻轻混合,再加入100μLDA抗体工作液,迅速充分混合1min,用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发,4℃孵育2h。孵育结束后,倒去孔中液体,每个微孔注入300μL洗脱液冲洗,翻转微孔板,倾去孔内液体,再重复以上洗板操作2次,在吸水纸上拍干。每孔加150μL过氧化氢和TMB充分混合,室温避光孵育30min。每孔加入50μL硫酸溶液(6mol/L)迅速混匀,终止反应,在30min内测量并记录450nm波长下的吸光度值。若试样稀释液经测定超出标准曲线的线性范围,可扩大稀释倍数后重新进行测定。5.5标准曲线的制作以失忆性贝类毒素标准系列工作液的质量浓度的以10为底的对数值为横坐标,以按式(1)计算的标准液的百分比吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。失忆性贝类毒素标准液(或样液)的百分比吸光度值按式(1)计算:A=S-S1S0-S1×100%…………………………(1)式中:A———百分比吸光度值;S———失忆性贝类毒素标准工作液或样液的平均吸光度值;S1———空白对照孔的平均吸光度值;S0———0μg/L的失忆性贝类毒素标准工作液的平均吸光度值。6分析结果的表述试样中失忆贝类毒素的含量按式(2)计算:GB5009.198—20164X=ρ×V×fm…………………………(2)式中:X———试样中失忆性贝类毒素的含量,单位为微克每克(μg/g);ρ———由标准曲线得到的试样待测液中失忆性贝类毒素的质量浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);V———试样提取液的体积,单位为毫升(mL);f———稀释倍数;m———试样的称样量,单位为克(g)。当测定值20μg/g时,则报告失忆性贝类毒素含量20μg/g。当测定值≥20μg/g时,则报告实际测定结果。注:任何失忆性贝类毒素含量大于20μg/g的样品即被认为是有害的,人类食用不安全。7其他本方法的定量限为1μg/g。液相色谱法8原理试样经甲醇溶液(50%)提取,强阴离子固相萃取柱净化,液相色谱分离,二极管阵列或紫外检测器检测,外标法定量。9试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为色谱纯,水为GB/T6682规定的一级水。9.1试剂9.1.1乙腈(CH3CN)。9.1.2甲醇(CH3OH)。9.1.3甲酸(HCOOH)。9.1.4冰乙酸(CH3COOH)。9.2试剂配制9.2.1乙腈溶液(10%):量取10mL乙腈,用水稀释至100mL。9.2.2甲醇溶液(50%):量取50mL甲醇,用水稀释至100mL。9.2.3甲酸溶液(0.1mol/L):吸取3.81mL甲酸,用水稀释至1000mL。9.2.4乙酸溶液(0.1%):吸取1mL冰乙酸,用水稀释至1000mL。9.3标准品软骨藻酸标准品(DA,C15H21NO6,CAS号14277-97-5):纯度≥90%。GB5009.198—201659.4标准溶液配制9.4.1软骨藻酸标准储备液(150μg/mL):准确称取8.3mg(精确至0.01mg)软骨藻酸标准品,用乙腈溶液(10%)溶解并定容至50mL。该软骨藻酸标准储备液浓度已经采用标准品的纯度进行换算,置于4℃避光保存,有效期6个月。9.4.2软骨藻酸标准系列工作液:分别吸取适量软骨藻酸储备液(150μg/mL),用乙腈溶液(10%)分别稀释成浓度为0.3μg/mL、0.6μg/mL、3μg/mL、15μg/mL、30μg/mL的标准系列工作液。标准系列工作液于4℃避光保存,有效期3个月。9.5材料9.5.1强阴离子固相萃取柱:500mg/3mL,或性能相当者。使用前分别用6mL甲醇、3mL水和3mL甲醇溶液(50%)活化。9.5.2微孔滤膜:0.22μm,水相。10仪器和设备10.1液相色谱仪:配有二极管阵列或紫外检测器。10.2分析天平:感量为0.01mg和0.01g。10.3均质器:转速≥10000r/min。10.4涡旋振荡器。10.5离心机:转速≥8000r/min。10.6固相萃取装置。10.7真空泵。11分析步骤11.1样品采集同5.1。11.2试样制备同5.2.1~5.2.4。11.3试样提取称取5g(精确到0.01g)试样于50mL具塞离心管中,加入10mL甲醇溶液(50%),涡旋混匀1min,超声提取5min,以8000r/min离心15min,移出上清液至25mL容量瓶中,残渣再加入10mL甲醇溶液(50%)重复提取一次,合并上清液,以甲醇溶液(50%)定容至25mL。11.4试样净化准确吸取5mL提取液移入已活化过的强阴离子固相萃取柱上,待液体以1mL/min的流速流出后,再依次用5mL乙腈溶液(10%),0.5mL甲酸溶液(0.1mol/L)淋洗,保持抽气2min,弃去流出液,最后用3mL甲酸溶液(0.1mol/L)洗脱,保持抽气2min,收集洗脱液(3mL洗脱液相当于1g试样),过0.22μm水相微孔滤膜后,供液相色谱测定。GB5009.198—2016611.5空白试验除不加试样外,采用与试样相同的操作步骤,得到空白溶液。11.6仪器参考条件a)色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径3μm,或性能相当者;b)流动相:乙腈+乙酸溶液(0.1%)(13+87);c)流速:1mL/min;d)柱温:35℃;e)进样量:10μL;f)测定波长:242nm。11.7标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以标准工作液的质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。软骨藻酸标准溶液的液相色谱图参见图B.1。11.8试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱仪中,得到峰面积,根据标准曲线得到试样溶液中软骨藻酸的质量浓度。12分析结果的表述试样中软骨藻酸的含量按式(3)计算:X=(ρ-ρ0)×Vm…………………………(3)式中:X———试样中软骨藻酸的含量,单位为微克每克(μg/g);ρ———由标准曲线得到的试样溶液中软骨藻酸的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);ρ0———由标准曲线得到的空白溶液中软骨藻酸的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);V———洗脱液的体积,单位为