酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1.次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/baitplasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ADfusionlibrary）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。2.共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7----的选择物是：ampicillin(氨苄西林)？1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his（组氨酸）(1000ml)（？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.60g（购买来就配好的）;葡萄糖20g(即2%)2)SD/-leu/-trp/-his(1000ml)酵母氮源（YNB）：6.7g;-leu/-trp/-hisDOsupplement0.62g;（购买来就配好的）葡萄糖20g.(即2%)3)SD/-leu/-trp(1000ml)（？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.64g（购买来就配好的）;葡萄糖20g(即2%)4)SD/-leu(1000ml)酵母氮源（YNB）：6.7g;-leuDOsupplement0.69g;（购买来就配好的）葡萄糖20g(即2%)5)SD/-trp(1000ml)酵母氮源（YNB）：6.7g;-ade/-leu/-trp/-hisDOsupplement0.74g;（购买来就配好的）葡萄糖20g(即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DOsupplement在920ml水中溶解，调PH至5.8（大约加10MNaOH200ul即可），之后补水至950ml。3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50ml40%葡萄糖。YPD培养基(1000ml)20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物20g/L琼脂（只有制作平板才用）20g/L葡萄糖(即2%)1xYPDA培养基(1000ml)20g/L蛋白胨10g/L酵母提取物0.03g/L腺嘌呤（即终浓度为0.003％）腺嘌呤可以耐受高温20g/L葡萄糖(即2%)实际配制的方法是：1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃以下时，再将15ml腺嘌呤溶液加入。（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）3.（蛋白胨20g；酵母提取物10g；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，121℃高压15min。注意：高压的温度和时间不能太长与太高，121℃高压15min即可。可以在YPDA中加入20g/L的琼脂，以配成平板。需要加kanamycin时，kan终浓度是10–15mg/L。（kanamycin可以20℃贮存一个月，加入到平板中去可以4℃贮存一个月。）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列贮存液来配制50%PEG3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。10XTEbuffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。10XLiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50℃以助溶。最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例）终浓度为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG400040%8mlof50%PEGTEbuffer1X1mlof10XTELiAc1X1mlof10XLiAc无菌1xTE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）10xTEbuffer:0.1MTris-HCl,10mMEDTA,pH7.5(高压)10xLiAc：1M用稀醋酸调节PH至7.5高压Forβ-galactosidase滤膜实验Zbuffer溶液：Na2HPO4•7H2O16.1g/L（如换Na2HPO4•14H2O则20.739g/L）NaH2PO4•H2O5.50g/L（如换NaH2PO4•2H2O则6.21g/L）KCl0.75g/LMgSO4•7H2O0.246g/L最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年X-gal溶液：X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20mg/ml.，–20°C避光保存Zbuffer/X-gal溶液：100mlZbuffer0.27mlβ-mercaptoethanol（β-巯基乙醇）1.67mlX-gal贮存液ONPG溶液：（即配即用）ONPG溶于Zbuffer中，终浓度4mg/ml，调PH至7.0.注意：1.ONPG需要1～2h才能溶解2.每次用之前新鲜制备。带有β-巯基乙醇的Zbuffer将0.27mlβ-巯基乙醇加入100mlZbuffer中即可为了转化成功的小提示：1.用一个1～3周龄（直径2～3mm）的菌落去接种液体培养基。如果菌落直径＜2mm，就用多几个菌落去接种。（也要大力涡旋使细胞团分散开来。）2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。一般BD是AD的两倍。（李博士：此要求一般是针对文库筛选而言）6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候shaketheplatebackandforth—notroundandround.（科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）一.复苏酵母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。（接种的时候采取四区分区画线法）二.酵母感受态细胞置备和转化步骤：1.取直径2～3mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。2.剧烈振荡或涡旋5min，使所有团块分散开来。3.转移酵母液到50mlYPD（？固体——也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。4.置于30℃摇床中，以250rpm的转速震荡培养基16～18h，直到OD6001.55.转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？固体）中，使最终OD600在0.2～0.3之间。6.30℃摇床以230rpm的转速震荡培养基3～4h直至OD为0.4～0.6.（IftheOD600is0.4,somethingiswrongwiththeculture）7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（20～21°C）离心5min8.弃去上清，加入25～50ml无菌水或无菌的1xTE重悬酵母。9.在1000g室温（20～21°C）条件下离心5min10.轻轻倒出（弃去）上清11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1xTE/1xLiAc（在实验开始之前置备）(至此酵母感受态细胞制备完毕)12.向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。13.再向每管中加入0.1ml酵母感受态细胞，并且震荡混匀。14.向每一管加入600ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。15.30℃摇床以200rpm的转速振荡培养30min16.向每一管加入70ulDMSO轻轻颠倒混匀，不要震荡。17.42℃水浴热激15min18.取出后在冰上冷却1-2min19.1000rpm室温离心5min，弃去上清。20.用0.5ml无菌的1×TE重悬酵母。21.取合适体积的菌液（一般是100ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30℃培养箱中培养2-4天。（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/–His/–Leu/–Trp，1/3涂在SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp，最后1/3涂在SD/–Leu/–Trp上。）（科内仅涂布二缺与四缺板）（在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个α-gal实验。如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。如果酵母能生长的话就接着做一个β-gal。所以有的人同时转化两种菌种。这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。三.α和β-gal实验：（我就做β-gal试验，要注意如果做β-gal的话，这时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol的24～28页）1.试剂：2.原理：ONPG为无色物质，在β-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol(硝基苯酚)，在420nm(OD410)处有光吸收。Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。（Na2CO3在配制时，不需要高压）3.实验方法一.Colony-liftFilterAssay（滤膜分析或滤膜试验）（这是定性试验）a)将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30℃培养2-4天。b)准备Zbuffer/X-gal溶液。c)为每一个要测试的平板准备好一张无菌的Whatman滤纸，置于100mm或150mm无菌平板中用2.5-5mlZbuffer/X-gal溶液浸泡。d)用无菌的镊子小心地将无菌Whatman滤纸覆盖到平板表面，要使所有的待测菌株都有部分沾到滤纸上。e)用注射器在滤纸上打3个或更多的不对称的孔，以标志方向。f)滤纸放入液氮中0.5～1min至结冰，之后再放置于室温融化，如此反复冻融3次。g)小心地将带有菌株的滤纸放到预浸泡的滤纸上，有菌株一面向上，注意两层滤纸中间不要有气泡。h)平板放到30℃培养箱中，观察其是否变蓝。一般阳性克隆在0.5～8h内会变蓝，超过8h容易产生假阳性结果。二.LiquidCultureAssay（以ONPG为底物的液体培养法）（这是定量试验）1)在合适的SD培养基中制备5ml过度培养物。注意：你所选用的SD培养基要适合你所用的系统和质粒。2)在进行实验当天，将ONPG以4mg/ml的浓度溶于Zbuffer中，振荡1～2h确保完全溶解。3)大力涡旋过夜培养基1min以分散细胞团块，立即转移2ml（0.5ml）过夜培养基物到8ml(2ml)YPD培溶液中。（以25%的含量加）4)30℃培养3～5h（230-250rpm）直至细胞进入对数生长期（1ml溶液的OD600应在0.5-0.8之间）在收获细胞的同时记录OD600值。注意：在检测OD值的时候，涡旋培养基0.5-1ml以分散细胞团块5)各吸取1.5ml（0.5ml）培养物到各3个1.5ml离心管（每个管子就是1.5ml），离心14000rpm/30sec。6)小心移去上清，加上1.5ml（0.5ml）Zbuffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。7)再次离心并移去上清，加上300ul（100ul）Zbuffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。这样，终浓度就是1.5/